白术对IEC-6细胞迁移多胺信号通路钙离子调控影响的研究

研究背景人体的消化道粘膜上皮构成了一道重要的屏障以抵御存在于肠腔内的毒性和免疫原性物质。粘膜上皮屏障完整性的破坏常发生于多种胃肠道病变,如炎症性肠病,腹部疾病,肠道感染以及NSAIDs肠病等。由于粘膜表面上皮具有强大的再生能力,胃肠道粘膜表面屏障的完整性即使在破坏后也能快速地重建。早期的损伤后粘膜修复(上皮整复)主要依靠上皮细胞迁移至损伤区域并重新密封胃肠粘膜的表面损伤,此过程不依赖上皮细胞增殖。上皮整复必须要有细胞内多胺的参与,在模拟上皮整复的体外小肠上皮(IEC-6)细胞模型中,刺激细胞迁移也需要多胺的参与。研究发现,多胺介导信号通路是IEC-6细胞迁移的主要调控因素,其中钙离子是该通路的关键指标。IEC-6细胞是一种非兴奋细胞,在细胞膜上不表达电压门控型钙离子通道,所以细胞内钙离子浓度的提高需依赖于钾离子通道的表达和激活。本研究围绕钙离子上游的钾离子通道表达和下游的调节细胞骨架的Rho GTP酶等的变化探讨白术提取物促进IEC-6细胞迁移的作用机制。祖国医学认为,脾胃为气血生化之源,后天之本。脾的功能旺盛则是保证机体健康及抵御外邪的重要因素。近年来胃肠道粘膜的保护功能日益受到重视。胃肠粘膜排列紧密的上皮细胞和上皮细胞表面粘液层的完整性和连续性构成了胃肠粘膜屏障存在的两个重要解剖学基础。胃肠粘膜损伤是某些中医证型如脾虚证的重要病理基础,胃肠粘膜保护是益气健脾中药的主要作用机理之一。胃肠粘膜保护是中医“脾”功能的重要内容,也是益气健脾中药的重要作用靶点。研究目的观察益气健脾中药白术对小肠上皮细胞迁移过程多胺介导信号通路钙离子调控的影响,探讨白术促进胃肠粘膜损伤修复的作用机制。在分子水平研究益气健脾中药促进粘膜损伤修复的调控机制,为阐述益气健脾中药治疗脾胃病的科学内涵提供依据。研究方法1.采用超声提取法以100%甲醇对白术进行提取,并用高效液相色谱法对白术提取物主要成分进行定性分析。2.在手术刀片划痕法IEC-6细胞迁移模型,以荧光相差倒置显微镜观察细胞迁移情况并拍照,用Ipwin32统计软件统计越过划痕的细胞迁移数。3.采用MTT法和实时细胞分析仪(RTCA)考察白术提取物对IEC-6细胞增殖的影响。4.采用柱前衍生高效液相色谱法检测IEC-6细胞迁移过程多胺(腐胺、精脒和精胺)含量。5.采用流式细胞仪结合荧光染料DiBAC4(3)和Fluo-3/AM分别检测IEC-6细胞迁移过程细胞膜电位(Em)和细胞质游离钙离子浓度([Ca2+]cyt)。6.荧光定量 PCR 法检测 IEC-6 迁移过程 Kv1.1、TRPC1、PLC-γ1、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA 表达。7.Western blot 法检测 IEC-6 迁移过程 Kv1.1、TRPC1、PLC-γ1、RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表达。8.激光共聚焦显微镜检测IEC-6迁移过程肌球蛋白Ⅱ(myosin Ⅱ)蛋白的表达和分布。研究结果1.白术药材以甲醇经超声提取后的3次得率分别为10.5%、10.05%和11.05%。用高效液相色谱法检测出白术提取物的3种主要成分白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,对实验所用的同批次白术药材分3次以高效液相色谱图进行相似度分析,发现其相似度分别为0.995、0.989、0.995,表明本研究中所用的白术药材质量稳定并且可控。2.在手术刀片划痕法IEC-6细胞迁移模型,筛选出白术提取物促进细胞迁移的3个给药剂量分别为50、100和200mg/L。细胞增殖实验表明,这3个剂量的白术提取物在24h、36h内对IEC-6细胞增殖的作用不明显。提示白术甲醇提取物的药理活性主要是促进细胞迁移,而对细胞增殖无明显影响。后续实验主要观察白术提取物促进细胞迁移的作用机制。3.受试药对IEC-6细胞迁移及多胺含量影响的结果表明,白术提取物(100mg/L和200mg/L)能促进IEC-6细胞迁移,逆转DFMO(多胺合成抑制剂)所致的细胞迁移抑制;能增加细胞迁移过程多胺含量,逆转DFMO所致的多胺(腐胺、精脒和精胺)含量减少。提示白术提取物促进细胞迁移与增加细胞内多胺含量有关。4.受试药对钾通道激活影响的结果表明,白术提取物(1OOmg/L和200mg/L)能逆转4-AP(钾通道抑制剂)所致的细胞迁移抑制;能提高细胞迁移过程钾通道Kv1.1 mRNA和蛋白表达,逆转DFMO所致的Kv1.1 mRNA和蛋白表达下降;增加细胞迁移过程膜电位(Em),逆转DFMO所致的Em降低。提示白术提取物促进细胞迁移的作用与钾通道激活、膜电位超极化有关。5.受试药对钙离子调控影响的结果表明,白术提取物(1OOmg/L和200mg/L)能提高细胞质游离钙离子浓度([Ca2+]cyt),提高钙通道蛋白TRPC1 mRNA和蛋白表达,提高调节胞内钙库释放的PLC-y1 mRNA和蛋白表达,可逆转DFMO所致的[Ca2+]cyt降低、TRPC1及PLC-γ1 mRNA和蛋白表达降低;若去除了细胞外的Ca2+(使用无Ca2+培养液),则不但空白对照组出现显著的细胞迁移抑制,且白术提取物促进细胞迁移的作用程度也明显弱于使用含Ca2+培养液时。提示白术提取物促进细胞迁移的作用与其影响钙离子调控有关,主要作用途径可能是通过促进细胞外Ca2+内流而增加[Ca2+]cyt,另一较弱的作用途径可能是增加细胞内钙库释放Ca2+。6.受试药对细胞迁移过程细胞骨架调控因素Rho GTP酶(RhoA、Rac1和Cdc42)影响的结果表明,白术提取物(100mg/L和200mg/L)能提高RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达,逆转DFMO所致的RhoA、Rac1、Cdc42mRNA和蛋白表达下降;此外,白术提取物可提高IEC-6细胞迁移过程肌球蛋白Ⅱ的表达,使肌球蛋白Ⅱ应力纤维含量增加,提示白术提取物对调节细胞骨架指标的影响是其促进细胞迁移的作用机制之一。研究结论益气健脾中药白术对胃肠粘膜损伤修复的作用与其促进损伤后上皮细胞迁移有关,作用机制与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关,尤其对细胞内[Ca2+]cyt调控的影响是其作用的关键指标之一。