现代药理研究表明,天然药物有效成分与金属离子形成的配合物具有更强的药理活性,其中以黄酮类化合物的研究最为广泛。荭草苷是中药金莲花总黄酮的有效成分单体,属于黄酮碳苷类,化学命名为2-(3,4-二羟基苯基)-8-beta-D-吡喃葡萄糖基-5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。荭草苷具有抗炎,抗病毒,体内外抗氧化、抗肿瘤作用,对缺血性心肌损伤具有保护作用。对荭草苷金属配合物的研究尚未见报道。本文以荭草苷和乙酸锌形成荭草苷锌配合物为研究对象,对其合成工艺条件进行优化,采用现代先进的技术鉴定手段进行配合物结构表征,对配合物体外抗氧化、抗肿瘤活性进行研究。
1荭草苷锌配合物的合成
以配合物产率为指标,单因素考察反应pH、反应温度、反应时间对配合物产率的影响,正交试验优化合成工艺条件。
2荭草苷锌配合物的结构表征
采用元素分析法、等离子发射光谱法、紫外光谱法、红外光谱法、热重分析法、核磁共振法对荭草苷锌配合物进行结构表征。
3荭草苷锌配合物的抗氧化活性
选择超氧阴离子自由基(·02-)、羟基自由基(·OH)、DPPH自由基产生体系为实验体系,考察荭草苷和荭草苷锌配合物的抗氧化活性。空白对照组加入相应的溶剂,样品组加入不同浓度的荭草苷和荭草苷锌配合物,用紫外光谱仪检测各组的吸光度。
4荭草苷锌配合物的抗肿瘤活性
本文选择EC-109(食管癌细胞)和MCF-7(乳腺癌细胞)肿瘤细胞为研究对象,采用CCK-8法,经过细胞复苏、培养、传代、接种后,空白对照组加入等量的培养液；溶剂对照组加入含DMSO(二甲基亚砜)的培养液,且使DMSO终浓度≤0.2%；实验组加入不同浓度的荭草苷和荭草苷锌配合物,浓度分别为5.00,10.00,20.00,40.00,80.00μmol·L-1。作用时间分别为24h,48h,72h,然后加入CCK-8液,用全自动酶联免疫检测仪在450nm波长测定吸光度。
结果表明：
1荭草苷锌配合物合成工艺：单因素分析表明,荭草苷锌配合物合成产率受反应pH值、反应温度、反应时间影响,正交试验优化合成工艺的结果表明,在反应pH值为8.5的条件下,65℃回流搅拌8h。洗涤沉淀数次后于60℃下真空干燥,得到了黄色固体产物,产率为72.64%。
2荭草苷锌配合物C、H、Zn含量结果：C、H、Zn元素含量实验值分别为41.65%,3.21%,14.68%,理论值分别为43.71%,3.30%,16.91%,实验结果与理论推算的数值基本相符,分析结果表明,荭草苷与锌离子可能形成了2：3的配合物。
紫外吸收光谱图显示,荭草苷两个吸收峰为250nm和350nm,配合物吸收峰为270nm和400nm,发生了红移,初步表明形成了荭草苷锌配合物。由红外光谱数据可知,荭草苷4位羰基振动频率υ(C=O)位于1656cm-1,形成配合物后,该吸收峰向低波数方向移动至1629cm-’,表明4位羰基可能参与了反应。荭草苷和荭草苷锌配合物的醚键(C-O-C)分别为1193cm-1,1198cm-1,葡萄糖环特征峰分别为812cm-1,848cm-1和808cm-1,845cm-1没有发生变化,苯环(C=C)由荭草苷的1613cm-1,‘变成荭草苷锌配合物的1565cm-1,表明苯环(C=C)受到配位的影响,共扼效应增强。荭草苷的3385cm-1为分子间羟基缔合特征峰,在形成配合物后波数增加到3422cm-1说明形成配合物后影响了羟基的缔合。荭草苷锌配合物在500cm-1～600cm-1出现吸收峰,为υO-Zn的振动吸收。
荭草苷锌配合物的热重图谱表明,配合物不含结晶水,共有两个失重阶段。荭草苷锌配合物第一阶段的失重是在120-150℃左右,失重率为5.68%,相当于失去4分子的配位水(理论失重率为6.24%),说明荭草苷锌配合物含有4分子的配位水。第二个失重阶段为260-520℃左右,失重率为73.54%,相当于失去2分子荭草苷(理论失重率为76.84%),得到的残余物是锌的氧化物ZnO。
荭草苷和荭草苷锌配合物1H NMR谱图显示,荭草苷位于δ13.16(C5-OH),δ10.82(C7-OH),δ10.04(C3-OH),δ9.06(C4-OH)处的羟质子信号峰在荭草苷锌配合物中只有δ10.81(C7-OH)存在,表明荭草苷7位羟基质子未参与配位,3’,4’,5位的羟基质子可能与Zn2+发生配位。
由以上分析可推测荭草苷锌配合物可能的化学分子式[Zn3(C21H15O11)2]·4H2O和化学结构式(如图1)。
3荭草苷和荭草苷锌配合物都具有清除·O2-、·OH、·DPPH的能力,且呈一定的量效关系。在1.0～8.0μg·ml-1范围内,荭草苷锌配合物各剂量组在清除·O2-、·OH、·DPPH能力上高于荭草苷配体同等剂量组,具有统计学意义(P<0.05)。
4荭草苷和荭草苷锌配合物都具有抑制EC-109、MCF-7的能力,且呈一定的量效关系。同一时相,不同浓度荭草苷和荭草苷锌配合物均对EC-109、MCF-7细胞生长增殖抑制率随着用药浓度的增高而增高(P<0.05),不同时相,同一浓度荭草苷和荭草苷锌配合物均对EC-109、 MCF-7细胞抑制率随时间延长而增加,具有显著性差异(P<0.05)。在不同时相,相同浓度的荭草苷锌配合物对EC-109、MCF-7细胞生长增殖抑制率均高于同浓度的荭草苷(P<0.05)。
综上所述,荭草苷与乙酸锌配位反应形成配合物的最佳工艺为：以无水乙醇为溶剂、反应pH值为8.5、反应温度为65℃、搅拌时间8h。得到了荭草苷锌配合物可能的化学分子式[Zn3(C21H15O11)2]·4H2O和化学结构式(如图1)。荭草苷锌配合物在抗氧化和抗肿瘤活性上优于荭草苷配体。
