目的:在前期实验研究基础上,本课题通过慢性束缚应激方法来建立肝郁脾虚证候动物模型,以免疫荧光双染、激光共聚焦成像、实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)等技术与方法,从基因与蛋白水平,分析下丘脑弓状核(Arcuate nucleus,ARC)中具有抑制摄食作用的瘦素受体(ob-R)、可卡因-安非它明调节转录因子(Cocaine amph-etamine-regulated transcript,CART)、前阿黑皮(Proopiomelanocortin,POMC)、α-促黑素细胞激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)的表达,为肝郁脾虚证候机体所表现的食欲下降、体重减轻、便溏等脾胃运化功能失常的生物学基础提供实验依据;同时以中药复方逍遥散(《太平惠民和剂局方》)作为干预用药,揭示其疏肝解郁、健脾以调节食欲的作用靶点与机理。方法:SD大鼠随机分为4组,即正常对照组(简称正常组)、7天模型组、21天模型组、逍遥散组。正常组大鼠不施加应激措施,正常饲养;7天模型组、21天模型组大鼠分别予每天连续3h、连续7天、21天的慢性束缚应激方法(将大鼠束缚固定于特制的T型台)建立动物模型;逍遥散组大鼠慢性束缚应激21天同时予灌服中药复方逍遥散。7天模型组于实验第8天取材;正常组、21天模型组与逍遥散组于实验第22天取材。动态观测4组大鼠体重、摄食量、饮水量、外观表征和行为学变化(旷场试验、高架十字试验)。以免疫荧光双染、激光共聚焦成像、RT-q PCR等技术与方法,观测大鼠下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH基因和蛋白表达。结果:1大鼠一般外观表征与行为学的变化与正常组大鼠比较,模型组大鼠体重、摄食量、饮水量呈缓慢增长的趋势;一般外观表现出现嗜睡懒动、反应迟钝、皮毛枯黄晦暗、耳廓爪部色泽变淡、大便干湿不调等变化;在束缚造模第0天,旷场试验各组大鼠5min内总穿格数、中央区停留时间、站立次数、修饰次数基本处于同一水平,随着实验进程,模型组大鼠的中央区停留时间明显增加,总穿格数、站立次数、修饰次数呈现减少的趋势。高架十字试验各组大鼠进入开放臂次数、开放臂停留时间、进入封闭臂次数、封闭臂停留时间基本无差别,随着实验进程,模型组大鼠进入开放臂次数和开放臂停留时间呈下降趋势,进入封闭臂次数及封闭臂停留时间呈现增加的趋势,而逍遥散组大鼠体重、摄食量、饮水量、行为学各项指标的改善比较明显,一般外观表征也有显著改善作用。2免疫荧光双染观测各组大鼠下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白表达变化在整个实验过程中,随着束缚的持续施加,21天模型组大鼠下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH的表达阳性面积、平均光密度、积分光密度、阳性细胞数均较正常组增加,CART、POMC、a-MSH与ob-R共染面积的表达亦较正常组增加;灌服3周逍遥散后,各项指标均有下降趋势,尤以ob-R与CART明显。3 RT-q PCR观测各组大鼠下丘脑ARC中ob-R m RNA、CART m RNA、POMC m RNA、α-MSH m RNA表达变化在整个实验过程中,随着束缚的持续施加,21天模型组大鼠下丘脑ARC中ob-R m RNA的表达较正常组明显增加(P<0.01),但CART m RNA、POMC m RNA、α-MSH m RNA的表达较正常组增加,无统计学意义(P>0.05)。逍遥散可以下调大鼠下丘脑ARC中ob-R m RNA、CART m RNA、POMC m RNA、α-MSH m RNA的表达。结论:1 21天模型组大鼠下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白与基因处于高表达水平,尤以ob-R明显,表明ob-R的蛋白与基因表达下降,是慢性应激肝郁脾虚状态机体出现食少、腹胀、便溏等脾胃失于健运的主要内在的中枢调节机制,7天模型组各指标较正常组增加不明显,表明慢性制动束缚7天,模型以肝郁样改变为主。2灌服逍遥散后,下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白与基因的表达水平较模型组大鼠降低,表明ob-R及调节的下行POMC/CART通路可能作为传统中药逍遥散疏肝健脾以调节脾胃功能作用的靶点。
