半夏Pinellia terrnata(Thunb.)Breit.、掌叶半夏Pinellia pedatisecta Schott.均为天南星科有毒中药。两者刺激性毒性极其相似,均表现出强烈的粘膜刺激,具有“戟人咽”的特性。如误食会出现口唇及咽喉肿痛、呼吸困难等症状,严重时可致死亡。论文作者所在课题组前期已经确定半夏、掌叶半夏的针晶是其主要刺激性毒性成分,因其晶型特殊,可引起家兔眼结膜强烈水肿、小鼠腹腔毛细血管通透性增强、大鼠足跖肿胀等炎症反应的发生,故被课题组称为“毒针晶”。前期研究结果显示毒针晶呈现针状,两头尖锐,表面具有明显的倒刺,这种晶体结构使其可刺入机体组织,从而引起一系列的炎症反应,但其作用机制尚不明确。课题组研究发现毒针晶主要由草酸钙和凝集素蛋白组成,继续研究发现毒针晶中的凝集素蛋白可诱发炎症,包括引起家兔眼结膜强烈水肿、大鼠足趾肿胀等。且半夏、掌叶半夏毒针晶及块茎中均含有凝集素蛋白,但其致炎机制仍需进一步研究确定。虽然临床常有半夏和掌叶半夏中毒病例,但是中毒后亦有解毒之法,生姜解天南星科有毒中药的毒性历代本草均有记载。清代《握灵本草》：“生姜汤多泡亦可火炮,尤能去毒。”葛洪《肘后备急方》：“中半夏毒以生姜汁干姜并解之。”现代研究表明,生姜解毒抗炎作用主要成分是姜辣素,但其解毒机制仍需深入研究。本论文将从整体、细胞和分子水平研究姜辣素拮抗半夏、掌叶半夏炎症毒性作用及其拮抗机制,主要工作内容和研究成果包括以下几方面：1.姜辣素拮抗半夏、掌叶半夏刺激性毒性作用研究采用小鼠腹腔炎症模型,研究姜辣素对半夏、掌叶半夏刺激小鼠腹腔炎症渗出液中炎症介质PGE2的影响；采用大鼠足肿胀模型,研究姜辣素对半夏、掌叶半夏刺激正常大鼠足趾肿胀度及足趾中炎症因子TNF-α、IL-1β的影响。结果表明,姜辣素可显著降低大鼠足趾肿胀度程度,同时显著降低小鼠腹腔渗出液和大鼠足趾中炎症介质PGE2和TNF-α、IL-1β的含量。采用扫描电镜法(SEM)观察半夏、掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白刺激后巨噬细胞的形态变化,同时观察加姜辣素组与未加姜辣素组巨噬细胞形态的差异。结果显示,半夏、掌叶半夏毒针晶可以刺激巨噬细胞活化、变形、吞噬异物的功能,细胞膜被破坏；半夏、掌叶半夏凝集素蛋白(PTL、PPL)刺激巨噬细胞后,巨噬细胞出现肿胀坏死,细胞膜破损；姜辣素可显著抑制巨噬细胞的变形及吞噬作用；抑制了PTL、PPL导致的细胞肿胀和细胞膜破损,并且高剂量的姜辣素使活化的巨噬细胞恢复至正常状态。采用大鼠腹腔巨噬细胞体外培养模型,研究姜辣素是否影响半夏、掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白刺激巨噬细胞后炎症因子IL-1p和TNF-α的表达。结果显示,刺激巨噬细胞1h后,与半夏、掌叶半夏毒针晶和PTL、PPL组相比,加入高、中剂量姜辣素组TNF-α口IL-1β的表达水平显著降低,并表现出一定的剂量依赖性。此实验结果表明,姜辣素对半夏、掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致的炎症因子释放有明显的抑制作用,在扫描电镜的基础上,进一步表明姜辣素对于毒针晶和凝集素产生的致炎毒性有拮抗作用。建立巨噬细胞-中性粒细胞体外共培养迁移模型,考察姜辣素对半夏、掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白刺激巨噬细胞(MΦ)导致的中性粒细胞迁移的影响,结果显示,刺激巨噬细胞1h后,与半夏毒针晶+MΦ、掌叶半夏毒针晶+MΦ和PTL+MΦ、PPL+MΦ组比较,加入高、中剂量的姜辣素组中性粒细胞数量显著降低。说明姜辣素对毒针晶和凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致的中性粒细胞迁移聚集有显著的抑制作用,并表现出一定的量效相关。中性粒细胞向炎症部位迁移是炎症反应发生的重要环节,因此,生姜解毒作用可能与其拮抗半夏、掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白导致的炎症毒性相关。上述研究表明半夏、掌叶半夏的致炎毒性表现为激活巨噬细胞,使其发挥防御功能,同时诱导促炎细胞因子的释放和中性粒细胞的迁移聚集,从而产生一系列的炎症反应,而姜辣素可以显著抑制半夏和掌叶半夏刺激巨噬细胞导致的一系列炎症反应,从而起到抗炎解毒作用。2.姜辣素拮抗半夏、掌叶半夏刺激性毒性机制研究采用Western Blot法,研究对姜辣素抗炎解毒机制,研究发现PTL、PPL刺激巨噬细胞1h后,巨噬细胞胞浆中的P65从细胞浆向细胞核内转移,NF-κB炎症信号通路被激活,表明PTL、PPL的致炎毒性与其激活NF-κB炎症信号相关。与PTL、PPL组相比,不同浓度的姜辣素组巨噬细胞胞浆内的P65含量显著上升,而核内的P65含量显著下降,并呈一定的剂量依赖性,显示姜辣素显著抑制了胞浆中的P65入核过程,阻断NF-κB炎症信号通路的激活,表明姜辣素拮抗半夏、掌叶半夏的毒性作用与其阻断NF-κB炎症信号通路相关。采用DCFH-DA荧光探针研究姜辣素对PTL=PPL刺激巨噬细胞导致的ROS过量生成的影响。实验结果表明PTL=PPL可以刺激巨噬细胞释放大量ROS,引起强烈的氧化应激反应；而姜辣素能够显著抑制PTL=PPL引起的强烈的氧化应激反应,减少巨噬细胞ROS的释放,并呈一定的剂量依赖性。ROS是炎症信号通路关键信号分子,故姜辣素抑制NF-κB炎症信号通路可能与抑制ROS的过量生成相关。为进一步研究建立姜辣素抑制ROS生成的机制,论文采用流式细胞术研究姜辣素对PTL、PPL刺激巨噬细胞导致的线粒体膜电位以及胞内游离Ca2+水平变化的影响。实验结果表明,PTL、PPL可以刺激巨噬细胞的线粒体膜电位降低和胞内游离Ca2+水平升高；而姜辣素能够显著抑制这种作用。研究表明姜辣素抑制凝集素产生的炎症毒性与其抑制线粒体膜电位以及胞内游离Ca2+水平变化相关。本论文的研究结果为深入研究半夏、掌叶半夏刺激性毒性的致炎机制和生姜解毒作用机制提供了研究基础及方法借鉴,对阐明了传统中医理论“生姜解天南星科有毒中药毒性”现代科学内涵奠定了理论和实践依据。
