GIT2抑制TLR介导的炎症反应

Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)信号通路通过识别病原菌相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)在宿主的先天免疫过程中发挥关键作用,如细菌DNA、LPS以及双链RNA等。如果TLR信号通路失控,就会导致核因子-κB (Nuclear factor-kappa B, NF-κB)活性的持续激活,进而导致慢性炎症以及自身免疫疾病等。因此,TLR信号负调控对于维持机体的免疫稳态至关重要。G蛋白偶联受体激酶相互作用因子2 (G-coupled receptor kinase-interactor 2,GIT2)是ARF-GAP (GTPase activating proteins)家族成员之一。到目前为止,还没有关于ARF-GAP家族成员直接调控TLR信号通路活性的报道。GIT2可通过其Arf-GAP酶活性负调控GTP酶Arf或通过与PIX相互作用负调控GTP酶Rac的活性。做为多结构域蛋白,GIT2参与多种细胞生物学过程,如调控细胞骨架、参与受体的内化以及作为支架蛋白参与信号转导。研究表明Git2缺失导致机体免疫缺陷：脾肿大、中性粒细胞趋化性紊乱以及过氧离子产生增加、CD4单阳胸腺细胞的选择受损等。上述结果表明GIT2在免疫调控中具有重要作用。我们前期通过酵母双杂交技术发现GIT2可与NF-κB信号通路中的很多蛋白发生相互作用,这提示GIT2直接调控NF-κB通路活性。但是,GIT2是否直接调控NF-κB活性以及调控NF-κB通路的生理和病理作用不清楚。NF-κB的活化是炎症反应的关键调节因子。因此,我们首先利用Git2缺失小鼠通过LPS内毒素休克模型研究GIT2在全身性炎症反应中的作用。研究发现,与野生型小鼠相比,Git2缺失小鼠对LPS引起的内毒素休克易感性增强,主要表现在：致死率增加、促炎性细胞因子水平的分泌以及肺组织中环氧化酶2(Cyclooxygenase 2, COX2)阳性数目的显著增加、脾肿大以及严重的肺损伤。此外,我们又研究了GIT2在大肠杆菌感染引起的脓毒性腹膜炎中的作用。Git2缺失小鼠除表现出与内毒素休克相类似的病理特征外,还表现出病原菌清除能力的降低。上述结果表明GIT2能保护小鼠免于内毒休克以及脓毒性腹膜炎,是脓毒症的重要抑制因子。鉴于GIT2在调控内毒素休克和脓毒性腹膜炎中调控作用,我们接下来利用巨噬细胞研究GIT2调控TLR介导的信号通路的机制。通过骨髓源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages, BMDMs),我们发现在LPS或Pam3CSK4的刺激下,Git2缺失的BMDMs产生炎性细胞因子能力显著高于野生型。在鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)中也得到了类似的结果。当加入TLR信号通路的抑制剂(TAK-242或OxPAPC)后,Git2-/-BMDMs在LPS或Pam3csk4刺激下产生炎性细胞因子的能力显著下降,与野生型BMDMs的差异无统计学意义。这表明GIT2负调控TLR介导的NF-κB活性。前期的研究表明GIT2负调控NF-κB活性的机制在于GIT2通过与TRAF6相互作用募集去泛素化酶CYLD特异性去除TRAF6 K63位的多聚泛素化链。为进一步说明GIT2负调控NF-κB活性在炎症反应中的作用,我们选择了硫酸葡聚糖钠(Dextran sulfate sodium, DSS)-诱导的实验性肠炎模型进行实验。与野生型小鼠相比,Git2缺失小鼠易发DSS诱导的实验性肠炎。其主要表在：致死率增加、体重减轻、结肠长度变短、炎性细胞因子含量增加,结肠组织病变严重；在抗生素干预下,野生型小鼠和Git2缺失小鼠的结肠病理损伤程度无统计学差异,提示Git2缺失导致的结肠炎易感性增强依赖于肠道菌群对NF-κB的直接或间接激活,尤其是TLR信号通路；同时,Git2缺失促进慢性结肠炎的发病。综上所述,我们的结果表明GIT2能直接调控TLR介导的NF-κB信号通路;Git2缺陷小鼠中,内毒素诱导的全身性炎症反应、大肠杆菌感染引起的脓毒性腹膜炎以及DSS诱导的实验性结肠炎的疾病严重程度增加；GIT2可能是治疗炎性疾病的重要靶分子。