绣球菌多糖提取、分离纯化及生物活性研究

绣球菌(sparassis crispa)具有抗癌、抗肿瘤、抗病毒、促进人体新陈代谢、降低血压血脂、提高造血及免疫调节等食用和药用的功能。富含多糖、蛋白质、碳水化合物以及多种维生素,其中多糖成分是绣球菌诸多生理功能的活性成分代表,尤其以β-葡聚糖含量最为显著,可达50%-60%。因此,提取绣球菌多糖具有良好的市场开发前景和经济价值。当前我国正在扩大绣球菌的栽培以及深加工的步伐,然而对其多糖的提取、产品开发、临床应用等仍为空白。本课题主要是采用复合酶对绣球菌多糖成分进行有效的提取；对多糖的脱蛋白工艺进行研究；探究绣球菌多糖的体外抗氧化活性以及结构鉴定等。以期为其系列产品开发及应用提供一定的理论依据。本文具体内容及结果如下：复合使用纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等对绣球菌多糖进行提取,采用正交试验确定复合酶最佳配比,进一步采用响应面法对酶解工艺参数进行优化；对绣球菌粗多糖进行脱蛋白处理,采用几种脱蛋白的方法进行对比,优选出一种蛋白脱除率高以及多糖损失率小的方法进行工艺优化；对提取出的多糖通过脱除蛋白成分；透析处理；柱层析等进行分离、纯化,得出均一的两个多糖组分SC1-1、SC2-1;对经过纯化的多糖组分、脱除蛋白后的组分、粗多糖成分等通过试验研究其体外抗氧化效果；用红外光谱法和核磁共振法对此多糖组分进行结构分析。(1)复合酶法提取绣球菌多糖酶复合使用提取绣球菌多糖的工艺得出,添加比例为木瓜蛋白酶0.6%、果胶酶0.4%、纤维素酶0.6%；最佳提取工艺为酶解时pH值4.16、时间为3.41 h、温度为53.73℃、料液比1：15.63。在此提取条件下多糖得率达到14.3%。(2)粗多糖溶液脱蛋白工艺研究从蛋白脱除率和多糖保留率综合评价,采用酶法、CaCl2法、HCl法、三氯乙酸(TCA)法及sevage法等对绣球菌多糖溶液进行脱除蛋白处理,试验结果为：TCA法对于绣球菌多糖溶液的蛋白质去除率和多糖保留率较其他方法有一定的优势(P<0.05)。正交试验结果表明在TCA浓度为15%,添加量为30%,振荡时间15 min,静置25 min。蛋白质脱除率及多糖保留率分别为：90.64%,80.59%。(3)体外抗氧化活性研究使用试剂盒,分别测定绣球菌多糖的总抗氧化能力、清除O2-·、·OH-和DPPH的能力,从而研究绣球菌多糖的体外抗氧化性活性。试验结果表明经分离纯化的单一组分SC1-1、SC2-1、已脱除蛋白的溶液及绣球菌粗多糖溶液均在不同程度上的具备了总抗氧化的能力、清除02-·、·OH-和DPPH的能力。纯化后的多糖组分SC1-1,SC2-1清除能力都不及未分离纯化的SC或SCl,因此说明多糖在对羟自由基的清除各组分之间具有协同作用。脱除蛋白的溶液及各纯化后的多糖组分对超氧阴离子的抑制能力显著高于粗多糖溶液(P<0.05)。纯化后的多糖组分酸性组分的多糖的总抗氧化能力比中性组分的多糖强(P<0.05)。在浓度为5 mg/mL时,已脱蛋白溶液在DPPH的清除能力上达到96.25%。这些体外抗氧化能力均与多糖溶液的浓度呈现显著的剂量效应。(4)多糖组分结构鉴定红外光谱分析结果显示SC1-1、SC2-1多糖组分的分子中均含有-OH、-COO-、C-O-C、C=C、-CH3、CH2、-CH等官能团。且为杂聚多糖,同时含有α-型和p-型糖苷键,其中以p型吡喃糖为主。核磁共振图谱显示糖链同时有(1→3)、(1→6)取代。推断多糖生物活性中起主要作用的应该是碳链中以(1→6)相连的p(1→6)D-吡喃型葡萄糖。SC1-1、SC2-1在结构上较为类似、相辅相成,共同促进多糖生物活性的表达。