白屈菜生物碱类成分提取、分离、纯化及体外抑菌作用研究

白屈菜（Chelidonium majus L.）为罂粟科白屈菜属植物,别名土黄连,山西瓜,“性凉,味苦,有小毒,入肺、心、肾三经”,首载于《救荒本草》,全草入药,具有清热解毒、镇痛、止咳、平喘、疔疮消肿之功效。喜生于山谷的湿润地带,林缘水沟边,广泛分布于欧亚大陆,北美等地,在我国主要分布于东北,华北等众多省份,自然资源极其丰富。 白屈菜中主要有效成分是生物碱类物质,全草约含生物碱0.97～1.87%,根含生物碱1.9～4.14%。迄今为止已经累计报道其中含有苯并菲啶型、原托品型、原小檗碱型、阿朴菲型四大结构类型共计29种生物碱。现代药理作用证明白屈菜中重要的活性成分是具有明显生物活性和生理功能异喹啉类生物碱,主要为白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱等。 迄今为止,关于白屈菜单体分离的研究较为深入,而白屈菜中生物碱提取工艺和含量测定方法的报道较少,并且在白屈菜的药理作用的研究中,关于白屈菜对畜禽生产常见的细菌性疾病的研究还未见报道。因此,本文由此出发,对白屈菜中生物碱开发为新型兽药的各个关键步骤均进行了一些研究,包括生物碱的提取、富集、纯化和药理作用研究,以期为白屈菜的大工业生产和进一步开发利用提供理论依据。 首先,白屈菜中生物碱提取工艺的研究。本文建立了反相HPLC法检测白屈菜碱含量的色谱条件,运用正交实验,分别以浸膏重量和白屈菜碱含量作为评价指标,考察了热浸和超声波两种醇提工艺的提取效果,运用SPSS14.0软件对结果进行分析,得到优化的提取工艺如下:以白屈菜浸膏为目标物质时,热浸提法提取效率优于超声波提取法,且差异达到极其显著,其提取条件为:65%乙醇、料液比1∶20,提取温度80℃,提取时间2 h。以白屈菜碱为目标物质时,超声波提取法效果优于热浸提法,差异极其显著,其提取条件为95%乙醇、料液比1∶10,提取温度50℃,提取时间0.5h,提取频率为85Hz。 其次,富集方法的研究。本文考察了六种常见大孔吸附树脂对白屈菜碱的吸附效果,分别是国产常用的D-101型大孔吸附树脂,AB-8型大孔吸附树脂,进口的HP-20型,HP-2MG型,SP-700型,SP-850型六种型号。筛选出适合白屈菜生物碱纯化工艺用树脂——SP-700型大孔树脂,此系列树脂优点突出,前处理和再生均较容易,新树脂使用30BV95%乙醇处理即可使用,过完树脂的浸膏容易干燥,经HPLC检测,杂峰与未过树脂之前大幅减少,富集效果较好。 第三,分离纯化的研究。采用常规的中药化学手段对白屈菜药材进行了系统的化学成分研究。采取硅胶正相柱层析,使用石油醚丙酮和氯仿甲醇洗脱系统,得到两个单体化合物,经MS、1HNMR、13C NMR、IR色谱鉴定其中一个为白屈菜碱。 第四,体外抑菌试验的研究。选择临床常见的致病菌,检测不同工艺不同部位的六种提取物的MIC值。不同工艺的提取物分别是:90%乙醇洗脱AB-8大孔吸附树脂浸膏、60%乙醇洗脱AB-8大孔吸附树脂浸膏、氯仿层提取物、水煎剂提取物、水层提取物、正丁醇层提取物。六种细菌分别是大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌耐药株、链球菌ATCC55121、沙门氏菌、大肠杆菌耐药株。结果发现:90%乙醇洗脱AB-8大孔吸附树脂浸膏对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌耐药株MIC值分别为7.8125 mg/mL和15.625mg/mL。60%乙醇洗脱AB-8大孔吸附树脂浸膏对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌耐药株、大肠杆菌耐药株MIC值分别为7.8125 mg/mL,7.8125mg/mL,15.625 mg/mL,15.625mg/mL;氯仿层提取物对对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌耐药株、大肠杆菌耐药株MIC值分别为7.8125 mg/mL,15.625mg/mL,31.25 mg/mL,15.625 mg/mL;水煎剂提取物对金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌耐药株MIC值分别为7.8125mg/mL,31.25 mg/mL。