目的：
本研究依据“艾灸治疗RA抗炎效应明确,胆碱能抗炎通路对全身和局部炎症均具有明显的抑制作用”的基本事实,以针灸理论为指导,艾灸家兔“肾俞”、“足三里”治疗实验性RA,围绕滑膜炎症关键病理环节,选择胆碱能抗炎通路作为研究切入点,以“艾灸刺激一胆碱能抗炎通路一抗炎效应”为研究主线,运用神经阻断、免疫组化、实时荧光定量PCR等方法技术,探索胆碱能抗炎通路在艾灸治疗RA抗炎效应中的作用机制,对于深化艾灸治疗RA的原理研究、丰富灸法的科学内涵具有重要的价值和意义。
方法：
将日本大耳白兔随机分为正常对照组、RA模型组、艾灸治疗组、艾灸治疗迷走神经切断组、艾灸治疗假手术组,用福氏完全佐剂塑造RA疾病模型,运用颈部左侧迷走神经干切断术作为干预手段,艾灸“肾俞”、“足三里”治疗。1.观察RA家兔的整体状况、体重、膝关节周长、滑膜组织炎症病理形态；2.采用Elisa法检测滑膜液中TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1含量；3.采用Elisa法检测血清中a7nAChR和ChAT的含量；分别采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测滑膜组织中a7nAChR、ChAT的蛋白表达和mRNA表达。4.采用免疫组化法检测滑膜组织中NF-κBp65、NF-κBp50、IκBα、IKKβ的表达。
结果：
1.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以明显改善RA家兔全身状况、膝关节肿胀、关节滑膜炎症病理变化,而在切断迷走神经的情况下其作用显著降低。
2.滑膜液中细胞因子检测结果显示：模型组与正常对照组相比较,RA模型组关节滑膜液中TNFα、IL-1、IL-6、HMGB1含量显著增高(P<0.01)；与RA模型组比较,艾灸治疗组、艾灸治疗假手术组关节滑膜液中TNFα、IL-1、IL-6、 HMGB1含量显著降低(P<0.01),而艾灸治疗迷走神经切断组无明显降低((P>0.05)；与艾灸治疗组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜液中TNFα、IL-1、 IL-6、HMGB1含量显著增高(P<0.01),但艾灸治疗假手术组无明显增高(P>0.05)。
3.α7nAChR、ChAT表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组血清中α7nAChR、ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著降低(P<0.01)；与模型组比较,艾灸组和假手术组血清中α7nAChR、 ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著增高(P<0.01),而艾灸治疗迷走神经切断组无明显增高(P>0.05)；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组血清中α7nAChR、ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著降低(P<0.01),但假手术组无明显降低(P>0.05)。
4.①NF-κBp65、NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组滑膜组织中NF-κBp65、NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ的表达显著增高(P<0.01)；与模型组比较,艾灸组和假手术组滑膜组织中NF-κBp65、 NF-KBp50、p-IκBα、IKKβ的表达显著降低(P<0.01),而艾灸治疗迷走神经切断组无明显降低(P>0.05)；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜组织中NF-KBp65、NF-κBp50、p-IKBα、IKKβ的表达显著增高(P<0.01),但假手术组无明显增高(P>0.05)。
②IκBα表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组滑膜组织中IκBα的表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较,艾灸组和假手术组滑膜组织中IκBα的表达显著增高(P<0.01),而艾灸治疗迷走神经切断组无明显增高(P>0.05)；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜组织中IκBα的表达显著降低(P<0.01),但假手术组无明显降低(P>0.05)。
结论：
1.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以明显改善实验性RA家兔全身状况、膝关节肿胀、关节滑膜炎症病理变化,表明艾灸具有明确的抗炎消肿、抑制滑膜炎症作用,而在切断迷走神经的情况下其抗炎作用显著降低,提示艾灸治疗RA的抗炎效应可能与兴奋胆碱能抗炎通路密切相关。
2.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以抑制实验性RA家兔滑膜液中细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和HMGB1水平,但在切断迷走神经的情况下其作用显著下降,提示兴奋胆碱能抗炎通路可能是艾灸抑制实验性RA家兔滑膜细胞分泌促炎细胞因子的重要机制之一。
3.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以上调ChAT在RA家兔外周血和滑膜组织中的表达,激活免疫系统的固有胆碱能系统,但在切断迷走神经的情况下其作用显著降低,提示艾灸可能通过兴奋迷走神经释放ACh,并与免疫细胞表面的a7nAChR结合,从而激活免疫细胞的固有胆碱能系统,转化为免疫系统内弥散的、持续的免疫调节。
4.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以抑制RA家兔滑膜组织中NF-κBp65、 NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ的蛋白表达,上调IκBα的蛋白表达,但在切断迷走神经的情况下其作用显著降低,因此推测艾灸可能通过抑制IKK/IκB/NF-κB信号转导通路活化,改善RA家兔滑膜NF-κB的高调控状态,抑制滑膜细胞炎性细胞因子和炎性介质的合成和分泌,从而实现其抗炎效应,胆碱能抗炎通路在其中具有重要作用。
