桂枝芍药知母汤对类风湿关节炎的骨保护作用及机制的实验研究

桂枝芍药知母汤(Guizhi-Shaoyao-Zhimu Decoction,GSZD)是《金匮要略》主治历节的经典方剂,临床应用于治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)效果颇佳,但对其作用特点、作用机制及物质基础缺乏系统深入研究。本课题以桂枝芍药知母汤抗RA骨破坏为切入点,探讨本方对RA骨保护作用的具体相关生物学机制和物质基础,为临床精准应用桂枝芍药知母汤治疗RA提供实验室依据。研究目的:(1)评价桂枝芍药知母汤对RA的骨保护作用:建立胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,研究本方对CIA骨关节破坏的抑制程度;运用网络药理学和分子对接,探索桂枝芍药知母汤抑制破骨细胞(osteoclast,OC)分化可能的活性物质、靶点和途径;通过体外实验明确本方是否可以直接抑制破骨细胞分化。(2)阐明桂枝芍药知母汤骨保护作用的靶点和途径:通过联合造模法建立全身性骨丢失模型,在无炎症和免疫调节的条件下再次评估桂枝芍药知母汤对全身性骨丢失的抑制作用;对原代成骨细胞(osteoblast,OB)和OC进行研究,探索本方骨保护作用的具体靶点和通路。研究假说:桂枝芍药知母汤可抑制破骨细胞的分化成熟,通过调节骨代谢,继而减少骨吸收,对RA起到骨保护作用。研究内容:(1)初步评价桂枝芍药知母汤对RA骨关节的保护作用(1)建立CIA大鼠模型,通过关节炎指数、足趾容积评价本方对关节肿胀症状的改善效果,HE染色、番红固绿染色、Micro CT显示桂枝芍药知母汤对关节骨破坏的保护程度,TRAP染色明确本方对OC的影响,ELISA检测促炎因子、RANKL和OPG的含量。(2)结合网络药理学,构建桂枝芍药知母汤有效化学成分和作用靶点的数据库,与类风湿关节炎疾病靶点库相结合,建立“药物-候选化合物-靶点-疾病”网络,选出其中节点度数较高的蛋白进行蛋白互做网络、GO和KEGG富集分析,筛选出与破骨细胞分化相关的靶点和通路。通过计算机辅助技术,筛选桂枝芍药知母汤中与作用靶点具有高结合值的成分,通过虚拟筛选技术从分子水平阐述本方骨保护作用的物质基础。(3)CCK8法检测桂枝芍药知母汤对RAW264.7细胞的影响,选出对细胞活性无明显影响的给药剂量。予RANKL诱导RAW264.7细胞分化成OC,本方干预后行TRAP染色、骨吸收陷凹染色及ELISA检测TRAP5b、Cathepsin K.、MMP-9以评估其骨吸收功能,Western Blot(WB))检测NF-κB信号通路相关蛋白。(2)评价桂枝芍药知母汤对全身性骨丢失的保护作用,探索本方骨保护作用具体的靶点和作用机制(1)通过联合造模法建立全身性骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠模型,通过HE、Masson、Micro CT评估本方对全身性骨丢失的改善作用,TRAP染色显示对OC的影响。ELISA法检测骨匀浆中ALP、TRAP5b、Cathepsin K、MMP-9的含量,WB和Quantitative Real-time PCR(QPCR)检测ALP、RANKL和OPG蛋白和基因表达。(2)培养大鼠颅骨源性成骨细胞,通过CCK8法筛选出合适的给药剂量,干预成骨细胞骨结节的诱导和ELISA法检测细胞培养液中ALP含量,评价桂枝芍药知母汤对OB的影响。(3)培养大鼠骨髓源性单核巨噬细胞,用RANKL和M-CSF进行诱导使之成为OC。CCK8法筛选出对合适的给药浓度,对此细胞进行干预,行TRAP染色、骨吸收陷凹染色评估其骨吸收功能,ELISA和QPCR检测TRAP5b、Cathepsin K、MMP-9的蛋白和基因表达,WB检测TRAF6、c-fos、NFATc1和IκB-α、p65/p-p65、p38/p-p38、ERK/p-ERK、JNK/p-JNK。研究结果:(1)桂枝芍药知母汤可减轻CIA大鼠骨关节的破坏,其骨保护的作用机制可能是通过多靶点、多途径抑制破骨细胞的分化成熟。(1)桂枝芍药知母汤可明显减轻CIA模型大鼠关节肿胀,降低关节炎评分和足趾容积(p<0.05)。同时该方可以减少CIA模型大鼠踝关节骨质、滑膜及软骨的破坏,减少踝关节OC的数量。在对CIA大鼠血清指标检测中发现桂枝芍药知母汤可降低TNF-α、M-CSF、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A等促炎因子的表达(p<0.05),并且发现该方可降低CIA模型大鼠滑膜及血清中RANKL(p<0.05)的水平,调节OPG/RANKL的比值。(2)网络药理学结果显示,搜集整理桂枝芍药知母汤化学活性成分180个,R A疾病相关靶点4604个,通过PPI、GO和KEGG富集分析显示桂枝芍药知母汤可通过多靶点、多途径对RA起到治疗作用,如免疫调节、抗炎、促进滑膜细胞凋亡等方面。本方可直接抑制OC分化以达到抑制骨破坏的作用,主要与TN F、JUN、PPARG、RELA、IKBKB、AKT1、MAPK8、STAT1、MAPK14等靶点相关,涉及PI3K-Akt、NF-κB、MAPK、JAK-STAT等信号通路。通过虚拟筛选,筛选出桂枝芍药知母汤与7个作用靶点(TRAF6、c-Jun、IκB-α、p65、p38、ERK、JNK)结合度较高的99个化合物,再次说明了本方对OC分化具有直接抑制作用。(3)通过CCK8试验确定以200、400、800μg/m L为给药剂量对RAW264.7细胞进行处理。用不同剂量桂枝芍药知母汤干预RANKL诱导的RAW264.7细胞后成熟破骨细胞数量减少(p<0.01),骨吸收陷凹面积减小(p<0.01),骨吸收特异性细胞因子TRAP5b、MMP-9、Cathepsin K的水平下降(p<0.05)。WB结果显示桂枝芍药知母汤对IκBα的降解有抑制作用(p<0.05),减弱p65的核转位和转录活性(p<0.05)。(2)桂枝芍药知母汤可以改善OP大鼠的全身性骨丢失;在体外可抑制破骨细胞分化的启动,通过抑制NF-κB和MAPK信号通路的蛋白磷酸化,减少下游骨吸收特异性因子的表达。(1)桂枝芍药知母汤高剂量组可提高OP大鼠的骨密度,抑制股骨远端骨骺端生长板的变薄和骨小梁的数量减少、厚度变薄,改善了骨小梁的连接度(p<0.05)。还可降低OC数量。桂枝芍药知母汤可提高ALP表达(p<0.05),降低MMP-9、TRAP5b和Cathepsin K等骨溶解相关细胞因子的表达(p<0.05)。WB及QPCR提示了本方具有调节RANKL/OPG平衡的作用(p<0.05)。桂枝芍药知母汤低、中剂量组对OP大鼠无明显疗效。(2)通过CCK8试验筛选后予200、400、800μg/m L桂枝芍药知母汤干预OC,实验结果显示桂枝芍药知母汤对成骨细胞骨结节形成无明显作用(p>0.05),对ALP分泌无明显影响(p>0.05)。(3)通过CCK8试验确定以200、400、800μg/m L为给药剂量,TRAP染色和骨吸收陷凹染色结果均提示桂枝芍药知母汤对OC的分化和骨吸收功能具有抑制作用(p<0.05),可减少细胞培养基中TRAP5b、MMP-9、Cathepsin K的水平(p<0.05)。桂枝芍药知母汤可抑制TRAF6的激活(p<0.05),减少NF-κB和MAPK信号通路的蛋白磷酸化(p<0.05),抑制了下游c-fos和NFATc1的表达(p<0.05)。结论:(1)桂枝芍药知母汤对RA存在的三种骨丢失形式均有抑制作用,明确了本方对RA骨保护的生物学效应。这为临床精准应用桂枝芍药知母汤治疗RA提供实验室依据:在辨证论治的基础上,本方适用于早期或活动期RA患者,尽早使用本方可延缓骨关节破坏和骨量减少。(2)本方骨保护的具体作用机制与破骨细胞分化密切相关。在体外实验中,桂枝芍药知母汤可直接抑制破骨细胞分化的启动;同时还对破骨细胞分化成熟过程中的关键途径NF-κB、MAPK有抑制作用,进而影响其分化成熟。本方对骨代谢的调节除直接作用破骨细胞外,可能还与炎症和免疫调节间接干预骨代谢有关,这为后续实验提供研究思路。不足与展望:(1)由于CIA模型造模时间短,还未有此类模型全身性骨丢失的实验研究,故本研究在第二章选用了骨质疏松模型进行实验。虽然实验结果提示本方对全身性骨丢失具有抑制作用,但是仅有高剂量组治疗效果较明显,这并不能说明桂枝芍药知母汤对RA全身性骨丢失的治疗效果。选用老年大鼠或自发性关节炎大鼠是否更适合此研究还有待探索。(2)本研究仅针对了影响破骨细胞分化成熟的下游靶点和途径进行了研究,只是对桂枝芍药知母汤抗RA骨丢失作用机制的一个方面进行了初步探索,缺乏深度。除此之外,本方可能还可以通过调节免疫、减少促炎因子等方面从上游调节骨代谢,抑制破骨细胞,减轻骨丢失,这是后续实验可以继续进行研究的。(3)对桂枝芍药知母汤骨保护的物质基础进行虚拟筛选后,由于时间不足,没有对筛选出的化合物进行提取和相关实验验证,缺乏对本方骨保护作用的深度挖掘。