葡萄白藜芦醇合成酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

白藜芦醇(resveratrol，简称Res)，是一种次生代谢产物，植物内毒素，具有抗氧化、抗肿瘤、抗血小板凝聚、防止人体低密度脂蛋白(LDP)氧化、提高肌体免疫力等功效；Res广泛存在于种子植物中，但是Res在植物体内的含量是非常低的，所以仅仅用传统的提取方法得到高丰度的Res非常困难，并且耗资过大。有关研究表明影响Res含量的主要因素是白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase，简称RS)的量，本研究试图通过基因工程的方法建立一种新的Res生产体系——毕赤酵母表达体系。 为了构建白藜芦醇合成酶(RS)基因的克隆载体，用PCR技术从葡萄叶片总DNA中扩增出RS基因全长，然后将其重组到克隆载体中。通过酶切对重组质粒进行了鉴定和测序，结果表明，RS基因已经正确克隆至pUC19中，将重组质粒转入大肠杆菌里，使RS基因能够在大肠杆菌里保存并且大量扩增，为RS基因构建表达载体表达白藜芦醇合成酶奠定了基础。 将重组后得到的克隆载体用加Kozak序列的引物扩增，凝胶电泳后回收目的条带，然后将回收条带和酵母表达载体pPIC3.5K用同样的限制性内切酶切割，用T4 DNA连接酶将两者连接。经酶切鉴定RS基因已经正确地连接到pPIC3.5K上。 用电激法将重组以后的酵母表达载体导入甲醇型酵母(Pichia.pasteoris)菌株GS115中，获得转化子。将转化子进行PCR筛选，得到酵母重组菌株。在以甲醇为唯一碳源的培养基上培养，进行了重组酵母菌株的诱导表达。