升陷乌梅汤治疗哮喘的网络药理学分析及干预气道重塑的实验研究

目的:（1）通过网络药理学分析,揭示升陷乌梅汤治疗哮喘的潜在靶点及机制,为实验研究提供理论基础。（2）基于Wnt7/β-catenin信号通路探索升陷乌梅汤抑制哮喘大鼠激素干预模型气道重塑的作用靶点及可能机制。方法:（1）网络药理学分析:检索中药系统药理学分析平台（TCMSP）、中药分子机制的生物信息学分析网络（BATMAN-TCM）等数据平台筛选升陷乌梅汤的主要有效成分及作用靶点,并通过人类基因数据库（Genecards）、药物靶标数据库（TTD）、比较毒理基因组学数据库（CTD）等疾病靶点数据库检索哮喘疾病的相关靶点。将升陷乌梅汤有效成分靶点与哮喘疾病靶点进行韦恩分析得到共同靶点,通过蛋白质相互作用数据库（String）进行有效成分-疾病共同靶点的蛋白相互作用分析（PPI）,运用基因功能注释分析工具（Metascape）的MCODE进行功能模块化分析,筛选关键靶点。利用富集分析数据库（David）对有效成分-疾病共同靶点进行基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析,并将代表性结果可视化为气泡图。（2）实验研究:50只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、哮喘组、全身激素模型组、布地奈德组及升陷乌梅汤组。除正常组外,其余各组大鼠通过卵蛋白致敏和雾化激发的方法诱导哮喘病程,并予正常组和哮喘组以外各组大鼠腹腔注射糖皮质激素,复制哮喘大鼠激素干预模型。在此基础上予布地奈德组大鼠雾化吸入[2 mL/（20 min.天）],予升陷乌梅汤组大鼠灌胃[0.81g/（kgd）],均干预7周。通过肺通气功能检测记录用力肺活量（FVC）、0.3秒用力呼气容积（FEV0.3）、0.3秒内平均流速（FEV0.3/FVC%）、每分钟通气量（MVV）、呼气峰流速（PEF）等数据;通过支气管激发试验记录并计算出吸气相气道阻力绝对值（RiR）、呼气相气道阻力绝对值（ReR）和肺动态顺应性绝对值（CdynR）;HE和Masson染色观察大鼠肺组织病理改变,并使用Image-pro Plus 6.0软件测定并计算出气道壁平滑肌细胞核计数（NCASMC）、支气管腔面积（Ai）、气道壁面积（Wat）及百分比（%TAt）、平滑肌层面积（WAm）及百分比（%WAm）;ELISA法检测肺泡灌洗液中转化生长因子β1（TGF-β1）、白介素-4（IL-4）和γ干扰素（INF-γ）的浓度,并计算IL-4/INF-γ比值;免疫组化、Western blot和RT-qPCR法检测各组大鼠肺组织中Wnt7、β-catenin、Collagen Ⅰ 及 Collagen Ⅲ的蛋白及 mRNA 表达水平。结果:（1）网络药理学分析:筛选出升陷乌梅汤165个主要有效成分和163个潜在靶点,哮喘靶点5974个;通过韦恩分析得到交集靶点127个;其后通过Metascape的MCOBE功能模块化分析交集靶点PPI网络得到显著性最高的功能模块及APP、MAPK8、GSK3B等40个关键靶基因。通过GO和KEGG富集分析得知这些靶点涉及细胞信号转导、平滑肌细胞收缩及增殖负调控、细胞增殖调控等生物学过程以及PI3K-Akt、NF-κB等信号通路。（2）实验研究:①与正常组比较,哮喘组和全身激素模型组大鼠NCASMc、WAt/Pi、WAm/Pi、%WAm及%TAt等气道重塑组织病理指标水平均显著增加（P<0.05）,且哮喘组大鼠Ai/Pi显著降低（P<0.05）;哮喘组大鼠FEV0.3、FVC、PEF及FEV0.3/FVC等肺通气功能指标显著降低（P<0.05）,全身激素模型组大鼠 FEV0.3 和 FEV0.3/FVC 显著降低（P<0.05）;哮喘组大鼠 RiR（2）、RiR（3）、Ri-R（4）、ReR（2）、ReR（3）及ReR（4）等气道反应性指标显著升高（P<0.05）,全身激素模型组大鼠RiR（4）和ReR（4）显著升高（P<0.05）,且两组各乙酰胆碱浓度下CdynR均显著降低（P<0.05）;哮喘组和全身激素模型组的TGF-β1、IL-4及IL-4/INF-γ等气道炎症指标均显著升高（P<0.05）,且两组的INF-y均显著降低（P<0.05）;哮喘组和全身激素模型组大鼠肺组织中的通路因子Wnt7和β-catenin、细胞外基质（ECM）蛋白Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的蛋白及mRNA表达均显著增高。②与哮喘组比较,各激素注射组均能降低NCASMc、%WAm及%TAt（P<0.05）等气道重塑组织病理指标水平,降低RiR（3）、RiR（4）、ReR（2）、ReR（3）及ReR（4）等气道反应性指标水平（P<0.05）,降低TGF-β1、IL-4和IL-4/INF-γ（P<0.05）等气道炎症指标水平,降低Wnt7、β-catenin、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ蛋白等通路因子/胶原的AOD值及其相对表达水平（P<0.05）,降低Wnt7、β-catenin和Collagen Ⅲ的mRNA相对表达水平（P<0.05）;并且各激素注射组还可增加通气功能指标FEV0.3和FEV0.3/FVC的水平（P<0.05）,增加气道反应性指标CdynR的水平（P<0.05）,增加气道炎症指标INF-y的水平（P<0.05）;此外,升陷乌梅汤组可降低气道重塑指标WAt/Pi及WAm/Pi的水平（P<0.05）,降低Collagen Ⅰ的mRNA相对表达水平（P<0.05）,增加Ai/Pbm的水平（P<0.05）。③与全身激素模型组相比,升陷乌梅汤组可进一步降低NCASMc、%WAm及%TAt水平（P<0.05）,增加FEV0.3/FVC和FEV0.3水平（P<0.05）;进一步降低RE（4）水平（P<0.05）,并增加 CdynR（3）及 CdynR（4）水平（P<0.05）;进一步降低 TGF-β1、IL-4 和 IL-4/INF-γ（P<0.05）,升高 INF-γ（P<0.05）;进一步降低 Wnt7、β-catenin、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ蛋白的AOD值和相对表达水平（P<0.05）;进一步降低 Wnt7、β-catenin 以及 Collagen Ⅲ 的 mRNA 相对表达水平（P<0.05）。结论:（1）升陷乌梅汤药物组成含有多种有效成分,作用机制复杂,可通过调控免疫炎症、气道平滑肌细胞（ASMC）的收缩和增殖等方面综合干预哮喘。（2）升陷乌梅汤可抑制哮喘大鼠激素干预模型气道重塑的进展,延缓大鼠肺通气功能下降及气道反应性升高,其作用机制可能与调控Wnt7/β-catenin信号通路的异常激活进而抑制ASMC增殖,以及干预气道炎症相关。