FoxO1介导白藜芦醇、葛根素抑制破骨细胞生成和活性的机制研究

氧化应激是骨质疏松的一个独立危险因素,氧化还原调控因子Fox O1通过上调过氧化氢酶、超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等抗氧化酶的水平在骨骼内稳态中发挥基础性的调节作用。白藜芦醇、葛根素作为天然的抗氧化剂,能够通过其抗氧化活性起到骨保护作用。因此,阐明白藜芦醇、葛根素在抗骨质疏松氧化应激损伤中的作用和分子机制具有重要的临床意义。我们课题组的前期研究表明,白藜芦醇能够通过抑制PI3K/AKT磷酸化通路调控白色脂肪组织中FoxO1的表达来改善高脂饮食引起的超重状态。然而,白藜芦醇和葛根素通过调控Fox O1信号通路,对体内唯一介导骨吸收过程的的破骨细胞的生成、活性及骨吸收功能的影响以及相关的分子机制尚不完全清楚。目的探究白藜芦醇、葛根素通过调节PI3K/AKT/FoxO1信号通路以及白藜芦醇通过调节Sirt1/FoxO1信号通路,对破骨细胞生成、活性及骨吸收功能的影响;从抑制骨吸收的角度,为白藜芦醇、葛根素防治骨质疏松的临床应用提供新的科学依据和实验基础。方法1)采用卵巢切除术建立骨质疏松大鼠模型,并对其进行药物干预,以观察白藜芦醇、葛根素对体内破骨细胞生成和活性的影响。健康3月龄雌性SD大鼠52只,分组及处理:（1）假手术组（Sham）;（2）去卵巢组（OVX）;（3）白藜芦醇组（RES）:给药剂量为40mg/kg/d;（4）葛根素组（PUE）:给药剂量为100mg/kg/d。所有大鼠术后1周开始皮下注射给药,假手术组及去卵巢组给以溶媒作为对照,连续10周。测定指标:微计算机断层扫描（μ-CT）测定右侧股骨松质骨和皮质骨参数;双能X线骨密度仪（DEXA）测定右侧股骨骨密度（BMD）;左侧股骨行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色;右侧胫骨行品红-苦味酸（VG）染色;酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定血清骨钙素（OC）、骨保护素（OPG）、I型胶原羧基末端肽（CTX-I）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRAP-5b）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、活性氧（ROS）及尿羟脯氨酸（HOP）;测定血清丙二醛（MDA）、SOD、及GSH-PX水平。2)为了探究白藜芦醇、葛根素抑制破骨细胞骨吸收效应的分子机制,采用RAW264.7细胞经100ng/m L RANKL诱导7d以形成破骨细胞,并对其进行药物干预。分组及处理:（1）对照（Control）组,（2）100ng/mL RANKL（RANKL）组,（3）10-4M H2O2（H2O2）组,（4）10-5M白藜芦醇（RES）组,（5）10-5M葛根素（PUE）组,（6）10-4M H2O2+10-5M白藜芦醇（H2O2+RES）组,（7）10-4M H2O2+10-5M葛根素（H2O2+PUE）组,（8）10-5M LY294002（LY,PI3K抑制剂）组;（9）10-5M EX-527（EX-527,Sirt1的特异性抑制剂）组;（10）10-5M白藜芦醇+10-5M EX-527（RES+EX-527）组。测定指标:采用CCK-8测定细胞24h、48h、72h生长活力;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测破骨细胞标志酶:基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、TRAP、组织蛋白酶K基因mRNA的表达水平;流式细胞仪测定细胞内ROS水平;测定MDA、SOD、GSH-PX水平;免疫蛋白印迹（Western Blot）检测破骨细胞内PI3K、AKT、p-AKT、Fox O1、p-FoxO1、Bim、caspase-3、过氧化氢酶、Sirt1、乙酰化-p53蛋白表达水平;Annexin-V/PI双染流式细胞仪测定细胞早期凋亡。结果1)体内实验结果显示:OVX组股骨松质骨和皮质骨BMD均较Sham组下降（P<0.05,P<0.01）;与Sham组比较,OVX组骨组织中破骨细胞数增加（P<0.01）,血清中OC、OPG的水平降低（P<0.01）,而CTX-I、TRAP-5b、RANKL及尿HOP的水平升高（P<0.01）,OPG/RANKL的比值降低（P<0.01）;OVX组ROS和MDA水平较Sham组显著升高,而抗氧化酶SOD和GSH-PX较其下降（P<0.05,P<0.01）。经白藜芦醇和葛根素分别干预后,与OVX组比较,RES、PUE组大鼠的股骨松质骨和皮质骨BMD升高（P<0.05,P<0.01）,骨组织中破骨细胞数减少（P<0.05,P<0.01）,表示成骨细胞分化和骨形成的血清OC的含量升高,具有骨保护效应的OPG水平也升高（P<0.05,P<0.01）,但代表破骨细胞活性和骨吸收状态的CTX-I和TRAP-5b的水平降低（P<0.05,P<0.01）,促进破骨细胞分化形成所必须的因子RANKL的水平降低（P<0.05,P<0.01）,OPG/RANKL的比值升高（P<0.01）;ROS和MDA水平降低,而SOD和GSH-PX水平升高（P<0.05,P<0.01）。2)体外采用RAW264.7细胞在100ng/mL RANKL的作用下诱导形成破骨细胞。（1）与RANKL组比较,10-4M H2O2诱导氧化应激后破骨细胞形成增加（P<0.01）,MMP-9、TRAP和组织蛋白酶K的mRNA表达水平升高（P<0.01）。经10-5M白藜芦醇和10-5M葛根素分别干预后,RAW264.7细胞的氧化应激状态较H2O2组得到了改善,其MDA和ROS的水平下降（P<0.01）,而抗氧化酶SOD和GSH-PX的水平升高（P<0.05,P<0.01）,TRAP染色阳性的多核破骨细胞数较H2O2组减少（P<0.01）,MMP-9、TRAP和组织蛋白酶K的mRNA表达水平亦较H2O2组降低（P<0.01）。（2）与Control组相比,在RANKL作用下,RAW264.7细胞ROS产生增加（P<0.01）,p-AKT及p-FoxO1的蛋白表达水平升高,FoxO1的蛋白表达水平降低;而H2O2增强了RANKL的以上效应。（3）与RANKL组比较,经白藜芦醇、葛根素、LY294002分别干预后,RAW264.7细胞分化形成的破骨细胞数减少（P<0.01）,MMP-9、TRAP和组织蛋白酶K的mRNA表达水平下降（P<0.01）,RAW264.7细胞内ROS的水平降低（P<0.01）,p-AKT及p-Fox O1的蛋白表达水平被抑制,而FoxO1、Catalase、Bim、caspase-3的蛋白表达水平升高,RAW264.7细胞的凋亡水平增加（P<0.01）。（4）Western Blot结果显示,白藜芦醇上调Sirt1的蛋白表达水平,降低乙酰化-p53的蛋白表达水平;RES+EX-527组FoxO1及其下游靶蛋白Catalase、Bim的蛋白表达水平均低于RES组。在RES和EX-527的共同作用下,细胞内ROS水平,TRAP染色阳性的破骨细胞数和破骨细胞标志酶的mRNA表达水平均高于RES组（P<0.05）,但其细胞凋亡水平却低于RES组（P<0.01）。结论1)白藜芦醇、葛根素能够通过其抗氧化活性降低由OVX诱导的RANKL的异常升高,上调OPG的表达,进而抑制破骨细胞的生成、活性和骨吸收功能,阻止骨微结构的破坏。2)RANKL通过激活AKT引起Fox O1的转录活性抑制,进而促进破骨细胞的形成,增强破骨细胞的活性。10-4M H2O2能够增强RANKL诱导破骨细胞形成的效应。3)白藜芦醇、葛根素通过抑制PI3K/AKT信号通路,上调FoxO1的蛋白表达水平和转录活性,进而抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞的分化,并诱导RAW264.7细胞发生凋亡。氧化还原调控因子Fox O1是白藜芦醇、葛根素发挥抑制骨吸收效应的关键靶点。4)白藜芦醇能够通过激活Sirt1上调FoxO1的蛋白表达水平和转录活性从而抑制破骨细胞的形成、降低破骨细胞的活性、增加破骨细胞的凋亡。