目的基于TLR3/4信号通路通过体内外实验探讨栝楼桂枝汤调控脑卒中后炎症反应的作用机制。方法1.健康清洁级SD大鼠(90只)随机分为假手术组,MCAO模型组,中药栝楼桂枝汤干预组,共3组。模型组和中药组行大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO)的制备,假手术组只分离动脉,不结扎、插线。造模后,进行神经行为学评分、Ashworth肌张力评级、Catwalk步态分析和TTC染色检测,鉴定模型成功与否。所有大鼠回笼饲养,假手术组和模型组不予任何治疗,中药干预组大鼠在术后第二天用栝楼桂枝汤(1.16g/m1)灌胃,1次/d,共7 d。栝楼桂枝汤干预结束后,进行腹腔采血和大脑皮层组织取材。采用Greiss反应和ELISA法检测大鼠外周血清中相关炎症介质的分泌水平；通过RT-PCR和Western-blotting法、免疫组化法检测炎症通路上的相关蛋白的表达水平；应用EMSA法、DNA-binding ELISA实验检测炎症通路上转录因子的活化水平。2.体外制备LPS刺激小胶质细胞BV2的炎症细胞模型,用栝楼桂枝汤的水提液进行干预。通过MTT实验筛选最佳的干预浓度,以对细胞无毒性为筛选标准,界定LPS和栝楼桂枝汤的最佳干预浓度或浓度区间。栝楼桂枝汤水提液干预结束后,取细胞培养上清并提取细胞总RNA和蛋白。应用Griess反应和ELISA法检测NO和炎症因子的分泌水平；通过RT-PCR和Western-blotting法检测炎症通路上的相关蛋白的表达水平；应用激光共聚焦显微镜、DNA-binding ELISA实验观察和检测炎症通路上转录因子的活化水平。制备小胶质细胞条件培养基干预PC12细胞,采用MTT实验和免疫荧光染色法观察栝楼桂枝汤对PC12细胞的生长活力和形态的影响。结果1.栝楼桂枝汤可显著改善MCAO大鼠的神经行为学缺陷和运动功能,并可显著降低MCAO大鼠的梗死体积,同时抑制患侧脑组织的炎症浸润及神经元死亡和炎症细胞的活化。2.栝楼桂枝汤可显著降低MCAO大鼠外周血中促炎因子的表达水平,促进抗炎因子的表达。同时栝楼桂枝汤可抑制通路NFκB上相关蛋白的表达及NFκB的活化水平,促进通路IRF3上相关蛋白的表达及IRF3的活化。3.栝楼桂枝汤水提液在体外可抑制小胶质细胞BV2的活化和炎症因子的分泌及促进抗炎因子的产生。栝楼桂枝汤可抑制活化小胶质细胞中炎症通路相关蛋白的表达及NFκ.B的活化水平,促进IRF3通路相关蛋白的表达及其活化有关。4.小胶质细胞条件培养基可抑制PC12细胞的生长,而栝楼桂枝汤可保护PC12细胞免于条件培养基的损伤作用。结论研究结果表明,栝楼桂枝汤对脑卒中所致的脑缺血再灌注损伤及其所致的运动功能障碍有较好的改善作用,其机制可能与调控TLR3/4介导的脑卒中后神经炎症有关。
