基于TLRs-MyD88与NLRP3通路的桂枝芍药知母汤治疗大鼠痛风性关节炎的作用机制研究

目的:在探讨桂枝芍药知母汤(Guizhishaoyaozhimu Decoction,GD)治疗痛风性关节炎(Gouty Arthritis,GA)相关理论基础上,基于TLRs-MyD88及NLRP3炎性体(NACHT-LRR-PYD-containing proteins3 inflammasome)信号通路,以GA相关的受体、信号衔接蛋白、炎性因子为观察指标,用三个实验观察GD对尿酸钠踝关节注射致GA模型大鼠关节滑膜组织及尿酸钠混悬液诱导的大鼠中性粒细胞、巨噬细胞炎性信号表达的影响,以期探明GD治疗GA的抗炎作用机制。方法:实验一采用尿酸钠踝关节注射致GA大鼠模型方法,对比观察秋水仙碱及GD给药组对模型大鼠关节滑膜组织中炎性信号因子TLR-2、TLR-4、NLRP3、MyD88、ASC、Capase-1、Capase-12、IKK-β、IκB-α、PPAR-γ、IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、COX-2、TGF-β1、NF-κB表达的影响,实验二、三采用细胞药理学方法,对比观察秋水仙碱及GD给药组对尿酸钠混悬液诱导的大鼠中性粒细胞、巨噬细胞炎性信号TLR-2、TLR-4、NLRP3、MyD88、ASC、Capase-12、IKK-β、IκB-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB表达的影响。主要观察指标及检测方法如下:⑴实验一180只雄性SD大鼠随机分配到3个实验,即关节滑膜IHC实验、ELISA实验、Westblot实验。各试验取大鼠60只,按体重随机分为6组,每组10只,即模型对照组、正常对照组、GD中、高、低剂量组(4,8,16 g?kg-1)、秋水仙碱阳性对照组(3×10-4 g?kg-1)。实验组均灌胃给药,正常与模型组给予等量蒸馏水,每天1次,连续7天。第5天灌胃前,大鼠足踝关节注射尿酸钠悬液诱导GA。取大鼠关节滑膜组织,IHC技术检测受体TLR-2、TLR-4、NLRP3的表达,Image-Pro Plus6.0图像分析系统测定平均IOD,WesternBlot法检测MyD88、ASC、Capase-1、Capase-12、IKK-β、IκB-α、PPAR-γ信号蛋白表达水平。酶联免疫吸附实验法(ELISA)测定炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、il-10、cox-2、tgf-β1表达水平,dpi-elisa方法检测nf-κb活性。⑵实验二、三大鼠30只,按体重随机分为5组,每组6只,gd中、高、低剂量组(4,8,16g?kg-1)、秋水仙碱阳性对照组(3×10-4g?kg-1)均灌胃给药,正常组给予等容积的蒸馏水,每天1次,连续给药7天。最后一次灌胃1h后,所有大鼠乙醚麻醉,取血清备用。sd雄性大鼠各20只,参照文献方法提取分离大鼠中性粒细胞与巨噬细胞,接种培养。细胞试验分为2个实验组(不加受体抑制剂,加nlrp3受体抑制剂),每个实验组均含6个组,正常对照组加入正常大鼠血清,模型对照组、中、高、低剂量组、秋水仙碱组全部滴加200μg·l-1的尿酸钠混悬液造模,同时滴加含药血清,置于co2细胞培养箱中,中性粒细胞孵育12h取出,巨噬细胞孵育2h取出。elisa法测定炎性因子il-1β、il-6、il-8、tnf-α、s100a8的表达,dpi-elisa方法检测nf-κb活性;westernblot法检测myd88、asc、capase-12、ikk-β、iκb-α信号衔接蛋白表达水平;rt-pcr法观测tlr-2、tlr-4、nlrp3mrna的表达。结果:⑴实验一造模72h后,大鼠关节滑膜组织中tlrs-myd88信号通路相关因子表达结果:与正常组比较,模型组大鼠关节滑膜组织中tlr-2、tlr-4平均iod值、myd88、ikk-β、il-2、cox-2、il-10、nf-κb蛋白表达水平明显升高(p<0.05);iκb-α、ppar-γ、tgf-β1表达明显降低(p<0.05);与模型组比较,秋水仙碱组、gd中、高剂量(8,16g·kg-1)组大鼠关节滑膜组织中tlr-2、tlr-4平均iod值、myd88、il-2、cox-2、il-10、nf-κb表达水平显著降低(p<0.05);gd中、高剂量组iκb-α、ppar-γ、tgf-β1表达明显升高(p<0.05),gd各剂量组ikk-β无明显变化。gd中、高剂量组对myd88表达抑制作用明显,秋水仙碱组比较有显著差异(p<0.05)。大鼠关节滑膜组织中nlrp3炎性体信号通路相关因子表达结果:与正常组比较,模型组大鼠关节滑膜组织中nlrp3、asc、capase-1、il-1β、il-6、tnf-α、nf-κb表达明显升高(p<0.05),capase-12表达明显降低(p<0.05);与模型组比较,秋水仙碱组、gd中、高剂量组nlrp3、asc、gd各剂量组capase-1、il-1β、il-6、tnf-α、nf-κb表达水平均显著降低(p<0.05),gd中、高剂量组capase-12表达明显升高(p<0.05)。gd中、高剂量组对capase-12、tgf-β1表达上调作用明显高于秋水仙碱组(p<0.05)。⑵实验二中性粒细胞孵育12h后,细胞中tlrs-myd88信号通路相关因子表达结果:与正常组比较,模型组大鼠中性粒细胞中tlr-2、tlr-4mrna、myd88、ikk-β、il-1β、il-6、il-8、tnf-α、s100a8、nf-κb的表达水平明显升高(p<0.05);iκb-α表达水平明显降低(p<0.05);不加受体抑制剂实验中,与模型组比较,秋水仙碱组及gd各剂量组tlr-2、tlr-4mrna、myd88、ikk-β、il-1β、il-6、il-8、tnf-α、gd高剂量组nf-κb及秋水仙碱组s100a8表达均明显降低(p<0.05),gd高剂量组iκb-α、s100a8表达明显升高(p<0.05)。tlr受体抑制剂明显抑制了中性粒细胞的tlr-2、tlr-4mrna、ikk-β、iκb-α、il-1β、il-6、il-8、nf-κb的表达。gd各剂量组中s100a8、iκb-α表达量显著高于秋水仙碱组(p<0.05)。中性粒细胞中nlrp3炎性体信号通路相关因子表达结果:与正常组比较,模型组大鼠中性粒细胞nlrp3mrna、asc(不加nlrp3受体抑制剂组)、il-1β、il-6、tnf-α、nf-κb表达水平明显升高(p<0.05),caspase-12表达水平明显降低(p<0.05);与模型组比较,给药各组nlrp3mrna、il-1β、il-6、tnf-α及秋水仙碱组、gd高剂量组asc、gd中、高剂量组nf-κb表达均明显降低(p<0.05),gd中、高剂量组caspase-12表达明显升高(p<0.05),而秋水仙碱组caspase-12表达无明显变化;nlrp3受体抑制剂明显减少了中性粒细胞nlrp3mrna,il-1βil-6、tnf-α的表达,但对nf-κb无明显影响。gd中、高剂量组caspase-12表达明显升高,与秋水仙碱组比较有显著差异(p<0.05)。⑶实验三巨噬细胞孵育2h后,细胞中tlrs-myd88信号通路相关因子表达结果:与正常组比较,模型组大鼠巨噬细胞中tlr-2、tlr-4mRNA、MyD88、IKK-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB表达水平明显升高(P<0.05);,IκB-α表达水平明显降低(P<0.05);不加受体抑制剂实验中,与模型组比较,给药各组TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β及GD高剂量组及秋水仙碱组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB的表达均明显降低(P<0.05),GD高剂量组IκB-α、S100A8、TGF-β1表达明显升高(P<0.05)。TLR受体抑制剂明显减少了巨噬细胞中TLR-2、TLR-4 mRNA、IκB-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1的表达。GD各剂量组中S100A8、IκB-α表达量显著高于秋水仙碱组(P<0.05)巨噬细胞中NLRP3炎性体信号通路相关因子表达结果:细胞造模2h后,与正常组比较,模型组大鼠巨噬细胞中NLRP3 mRNA、ASC、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表达水平明显升高(P<0.05);Caspase-12表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,给药各组NLRP3 mRNA、TNF-α及GD高剂量组ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB表达均明显降低(P<0.05),GD中、高剂量组Caspase-12表达明显升高(P<0.05),且与秋水仙碱组比较有显著差异(P<0.05)。NLRP3受体抑制剂明显抑制了巨噬细胞NLRP3 mRNA、ASC、Caspase-12、IL-1β的表达,但对NF-κB活性无明显影响。结论:三个实验结果一致表明:GD治疗GA的作用机制可能与降低TLR-2、TLR-4、NLRP3受体及MyD88、ASC蛋白表达,增加PPAR-γ、IκB-α表达,抑制IL-1β分化成熟及NF-κB活化,降低Toll-MyD88及NLRP3炎性体信号通路炎性因子表达有关。细胞实验结果分析提示:与秋水仙碱组不同的是,GD能够上调模型大鼠组织细胞中IκB-α、PPAR-γ、TGF-β1、Capase-12表达,说明GD可能通过提高抗炎调控因子的表达负反馈抑制炎性信号通路所介导的GA炎性反应。