虫草发酵及其代谢产物的分离与生物活性研究

虫草是一类珍稀的真菌药材资源,具有代谢产物和生物活性多样的特点,在功能性食品和生物医药领域展现出巨大的应用前景。本学位论文主要以我国特有的药用虫草新资源——戴氏虫草Cordyceps taii Z.Q. Liang & A.Y. Liu (1991) (= Metacordyceps taii)和江西虫草Cordyceps jiangxiensis Z.Q. Liang, A.Y. Liu & Y.C. Jiang (2001)为研究对象,立足于虫草可持续开发利用尚待解决的一些科学技术问题,在前期研究的基础上,重点就虫草菌丝体及其多糖的发酵生产、生物活性、菌丝体的化学组成分析及其代谢产物的分离纯化等展开研究。 虫草及其代谢产物的发酵生产是虫草研究领域的重要课题。率先把非线性数学模型——期望函数法引入到真菌发酵过程优化,针对江西虫草发酵菌丝体及其多糖两个目标的发酵生产条件进行优化。优化后的发酵条件使虫草菌丝体产量和多糖产量分别高达24.5g/L和8.9g/L,均比优化前增加了2倍多。这为发酵过程复数个目标的优化提供了成功的事例,也奠定了江西虫草可持续开发利用的基础。同时,还采用一种组合的优化实验设计策略,即单次单因子法与Plackett-Burman设计、最陡爬坡法、中心组合设计等响应面法联用的策略,对戴氏虫草胞外多糖的发酵生产条件进行优化,建立了预测戴氏虫草多糖发酵生产的二次多元回归数学模型,并获得了最适的发酵生产条件。优化后的条件使多糖产量从0.77g／L提高到40g/L以上,这为戴氏虫草活性多糖的进一步研发提供了有力的保障。 在上述发酵条件的研究基础上,对戴氏虫草和江西虫草发酵菌丝体多糖组分的生物活性及作用机制进行了探索。观察到这两种虫草的菌丝体多糖组分均具有较强的抗氧化新功效。尤其是大部分多糖组分清除超氧阴离子自由基的活性明显强于硫脲和丁基羟基茴香醚两个阳性对照组；有两个戴氏虫草发酵菌丝体多糖组分,在中低剂量时螯合Fe离子的活性,明显强于EDTA阳性对照组；戴氏虫草多糖的抗氧化作用机制与显著提高内源性抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的活性以及明显降低脂质过氧化代谢产物MDA的水平有关。另外,观察到江西虫草发酵菌丝体多糖组分MPCJ4和MPCJ5存在非免疫应答的抗肿瘤作用机制,即,作用于肿瘤细胞G1／S期,阻断细胞进入G2／M期,并诱导G1期细胞凋亡,且其与Caspase依赖的凋亡途径有关。 除了多糖这一虫草的主要活性成分之外,江西虫草和戴氏虫草发酵菌丝体中还有其它具有重要价值的营养成分和生物活性物质。为此,对戴氏虫草、江西虫草和古尼虫草Cordyceps gunnii (Berk.) Berk. (1859)发酵菌丝体的营养成分、生物活性物质及潜在的有毒化学物等进行了系统的定性定量分析。古尼虫草、戴氏虫草和江西虫草发酵菌丝体中多糖、虫草酸和核苷类化合物的水平均为江西虫草>戴氏虫草>古尼虫草；古尼虫草、戴氏虫草和江西虫草的发酵菌丝体中富含不饱和脂肪酸和氨基酸,不饱和脂肪酸分别占总脂肪酸中的78.7%,66.9%和79.0%；古尼虫草、戴氏虫草和江西虫草虫草发酵菌丝体中总氨基酸的含量在146.0-168.3mg/g范围,其中必需氨基酸分别占总氨基酸中的37.05%、39.39%和39.37%；古尼虫草、戴氏虫草和江西虫草发酵菌丝体均富含Fe、Zn、Se, Cr和Co等微量元素,Al、Sn、Pb、Cd、As和Hg等潜在毒性物质含量均低于国家的限制水平。综上,江西虫草、戴氏虫草和古尼虫草发酵菌丝体富含较高利用价值的营养成分和生物活性物质,所含潜在毒性物质均在安全范围内,具有作为食药品新资源的潜力。同时,研究结果为建立这些虫草菌丝体生产的相应质控体系提供了实验依据。 在虫草菌丝体营养成分及生物活性物质的全面分析过程,本文还建立了虫草菌丝体中作为重要质控指标的虫草酸和核苷的检测方法。确立了酶标仪比色法检测虫草酸,该方法可替代常规分光光度比色法,其灵敏度、精确度和稳定性良好,准确度较高,并具高通量检测特点；还建立了同时检测7种主要核苷与碱基的高效液相色谱法(HPLC-PDA)。该方法有良好的精密度、稳定性和重复性,比已报道的HPLC方法的分析时间缩短了一半(12min),并能更全面反映虫草及其发酵菌丝体产品中的核苷及碱基；采用HPLC-PDA法检测到江西虫草发酵菌丝体含有尿嘧啶、尿苷、鸟苷、腺嘌呤、腺苷和虫草菌素,其中尿苷(7802.14gg／g)和腺苷(2705.92μg/g)是主要的核苷成分。 众所周知,虫草的研发价值除氨基酸等营养成分以及多糖、虫草酸、核苷等生物活性物质外,还有其它许多有用的次生代谢产物,这些是功能食品研发和新药创制的源泉,也是真正实现虫草高附加值二次化学成分开发利用的基础。在前期抗肿瘤活性检测的基础上,首次从江西虫草发酵菌丝体抗肿瘤有效部位中分离出30多种单体,其中鉴定出18种化合物,即二十四烷酸(2)、十八烷酸-α-单甘油酯(5)、江西烯酮酯jiangxienone(7)、菜油甾醇-二十二烷酸酯(8)、麦角甾醇-十六烷酸酯(9)、尿嘧啶核苷(14)、麦角甾醇(21)、5a-麦角甾-7,22-二烯-3β-醇(22)、丁二酸(23)、尿嘧啶(24)、腺嘌呤(25)、腺嘌呤核苷(26)、烟酸(27)、3’-甲氧基尿嘧啶核苷(28)、2’-甲氧基腺嘌呤核苷(31)、2’-脱氧尿嘧啶核苷(32)、L-焦谷氨酸甲酯(33)和龙脑香醇酮(34)。在这18种化合物中,化合物7-9为新化合物,属于甾体类。其中化合物7(江西烯酮酯)的氧化度高,抑制肿瘤细胞增殖活性明显强于一线化疗药物顺铂,具有创制抗肿瘤新药的潜力。此外,还有10个已知化合物(2,5,22-23,27-28,31-34)为首次从虫草属真菌中获得。这些研究结果丰富了虫草天然产物化合物库,为新药创制增添了化合物资源,也为江西虫草菌丝体的二次化学成分研发奠定了基础。