针灸对健康小鼠环磷酰胺所致骨髓抑制Notch信号通路影响的研究

目的:围绕针灸改善健康小鼠化疗后骨髓抑制、提升外周血白细胞这一主题,进一步揭示针灸对化疗后白细胞影响的变化规律;以Notch信号通路研究为切入点,利用生物芯片筛选CTX健康小鼠骨髓造血细胞中Notch信号网络相关差异基因,应用免疫组化法进一步检测差异基因的蛋白表达,从而进一步筛选出针灸拮抗化疗所致骨髓抑制作用中Notch信号通路上的重要信号分子,并运用RT-PCR和Western-bolt方法检测这些重要信号分子的m RNA的转录水平和蛋白量,从分子生物学的层面探讨针灸抗化疗后骨髓抑制的作用机制,为针灸治疗化疗后骨髓造血功能障碍提供实验室依据。方法:选用雄性昆明种SPF级清洁小鼠40只,体重18±2 g,在实验室自由饲养3天后,称量各小鼠体重后,运用随机分层分组的方法将小鼠随机分到空白组(A组)、模型组(B组)、针刺组(C组)、艾灸组(D组),每组10只。分组后用苦味酸溶液对各组小鼠先染色再进行编号。检查基础白细胞计数后,将两极小鼠删除,每组仅保留8只用于实验的小鼠。依据《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》(中华人民共和国卫生部药政局编)的造模方法,用环磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制小鼠模型。按照100mg/kg/d用药量腹腔注射,连续3天。依据环磷酰胺药代动力学过程,4小时后药物活性消失,模型即成(中山医学院等编著.基础药理学.人民卫生出版社,1979:442.)。空白组小鼠按体重0.02ml/g的用药量,注入注射用生理盐水。模型复制成功后4小时,按照造模的顺序进行治疗。空白组、模型组只抓取、固定,不治疗。针刺组将小鼠俯卧固定于自制木板上,选用华佗牌美容毫针(针具规格:0.19×10mm,针柄20mm),采用管式进针法,直刺,进针深度为3mm,留针6min,每日1次,连续5天。艾灸组治疗时将小鼠俯卧固定于自制小鼠固定板上,美容细艾条点燃后,(艾条规格:0.4×25cm),在距离穴位皮肤2cm处固定悬灸,每穴3min,连续5天,每天治疗1次。治疗后观察针灸对白细胞的影响规律,并应用基因表达谱芯片对治疗5天后的CTX健康小鼠的骨髓细胞进行Notch信号通路相关差异基因的初步筛选,再应用免疫组化法检测差异基因的蛋白表达,从而进一步筛选出具有显著差异的基因,然后对这些显著性差异基因运用RT-PCR和Western-bolt方法分别检测其基因m RNA的转录水平和蛋白表达量。通过观察针灸后CTX健康小鼠Notch信号通路差异基因表达水平的变化,从骨髓细胞信号转导通路方面探讨针灸改善化疗后骨髓抑制、提升白细胞的作用机制。整个实验过程严格遵守国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。结果:1.“实验一”结果显示:造模之前各组小鼠基础白细胞计数无显著差别(P>0.05)。造模成功后第2天、第3天小鼠外周血白细胞逐渐下降,与空白组比,其余各组小鼠的白细胞计数均降低,统计有显著差异(P<0.05);针刺组、艾灸组与模型组相比,白细胞计数无显著性差异(P>0.05)。治疗后第3天,针刺组与艾灸组均开始回升,针刺组效果优于艾灸组,且有显著性差异(P<0.05);在第4～5天针刺组、艾灸组白细胞均明显升高,第5天已达正常值。2.“实验二”结果显示:应用基因芯片对各组小鼠骨髓造血细胞Notch信号通路相关差异基因进行初步筛选,共筛选出7个差异基因:delta1、notch1、notch 2、jag1、jag2、numb1、numb2。3.“实验三”结果显示:治疗5天后,与空白组比,模型组中notch2和jag1、jag2上调,numb1和numb2下调,且具有显著性差异(P<0.05);delta1、notch1无统计学意义(P>0.05);与模型组比,针刺组与艾灸组中notch2和jag1、jag2下调,numb1和numb2上调,且具有显著性差异(P<0.05)。与针刺组比,艾灸组中的jag2下调,具有显著性差异(P<0.05)。在基因表达谱芯片筛选出的7个差异基因中又进一步筛选出numb1、numb2、notch 2、jag1这4个具有显著性差异的基因。4.“实验四”结果显示:健康小鼠注射CTX后,骨髓细胞Notch信号通路中显著性差异基因jag1、notch2、numb1、numb2中,与空白组比模型组numb1、numb2 m RNA表达降低,且具有显著性差异(P<0.05),jag1、notch2 m RNA表达升高但无统计学意义(P>0.05),经过治疗后虽然与模型组比较针刺组、艾灸组均无统计学意义,但针刺、艾灸后numb1、numb2 m RNA表达均上调,jag1、notch2 m RNA表达均下调,且艾灸组优于针刺组,但无显著性差异(P>0.05)。5.“实验五”结果显示:健康小鼠注射CTX后,jag1、notch2蛋白含量升高,numb1、numb2蛋白含量下降,说明CTX可引起健康小鼠骨髓细胞中的numb蛋白(numb1、numb2)含量下降,导致notch蛋白(jag1、notch2)含量增加。针灸治疗5天后,针刺组、艾灸组与模型组比,jag1、notch2蛋白含量下降,且具有显著性差异(P<0.05);针刺组、艾灸组与模型组比,numb2含量增加,且艾灸组具有显著性差异(P<0.05),针刺组、艾灸组与模型组比,numb1蛋白量变化虽无显著性差异(P>0.05),但有升高趋势,且针刺组较艾灸组高。提示针灸可以通过增加numb蛋白的含量、降低notch蛋白含量。结论:1.针灸具有减轻CTX健康小鼠骨髓抑制,提升白细胞的作用,且白细胞的变化与导师组多年总结的变化规律相一致:即在治疗第3天开始回升,在第5天达到正常值,针刺与艾灸两种方法比较无显著差异。2.通过基因表达谱芯片和免疫组化的筛选,在各组健康小鼠骨髓造血细胞Notch信号通路上,共筛选出numb1、numb2、notch1、notch2、jag1、jag2、delta1等7个差异基因,其中numb1、numb2、notch2、jag1具有显著性差异。3.针刺、艾灸可以上调numb1、numb2 m RNA的表达,下调notch2、jag1 m RNA表达,可以促进numb1、numb2蛋白含量的增加,降低notch2、jag1蛋白含量。4.针灸减轻CTX化疗引起的骨髓抑制,其可能的作用机制是:针灸能够通过上调骨髓组织中Numb的含量,下调notch2、jag1含量,抑制过度激活的Notch信号通路,使骨髓造血干/祖细胞细胞增殖作用增强,分化细胞减少,从而造血干/祖细胞的数量得以增加,增强骨髓造血功能。5.通过numb-Notch信号途径的调节,可能是Notch信号通路起到抗骨髓抑制,提升白细胞,增加机体免疫功能的重要途径。