Lyn激酶通过抑制IL-13诱导内质网应激减轻气道上皮细胞黏液高分泌

目的:研究Lyn激酶在白细胞介素-13(IL-13)诱导气道上皮细胞内质网应激(ER应激)和MUC5AC中的作用机制。方法:1.用人支气管上皮细胞(16HBE细胞)分别构建Lyn高表达细胞株和Lyn低表达细胞株:(1)将我们实验室已构建的Lyn高表达载体通过Lipofectamine 2000,转染到293T细胞中以获得感染性慢病毒载体颗粒,使用Lyn高表达慢病毒转染16HBE细胞,构建Lyn高表达细胞株(Lyn+/+-16HBE细胞株);同时,使用只含有GFP的慢病毒转染16HBE细胞,构建对照组细胞株(CTRL-16HBE细胞株)。(2)用Lyn siRNA通过Lipofectamine 2000,转染16HBE细胞构建Lyn低表达细胞株(Lyn-siRNA-16HBE细胞株);同时,使用非沉默siRNA转染细胞,构建阴性对照细胞株(siCTRL-16HBE细胞株)。2.细胞分组:(1)用IL-13分别刺激Lyn+/+-16HBE细胞和CTRL-16HBE细胞,PBS刺激作为对照。(2)分别用PI-103和4-PBA刺激Lyn-siRNA-16HBE细胞和siCTRL-16HBE细胞,PBS刺激作为对照,之后再加入IL-13或PBS刺激各组细胞。3.检测方法:(1)Western blot法检测Lyn、p-Lyn、NFκB p65、p-NFκB p65、Akt1、p-Akt1、PI3K p85α、p-PI3K p85α、CHOP、BiP、组蛋白H3、β-actin蛋白的表达情况。(2)免疫荧光法检测MUC5AC、BiP、CHOP、NFκB p65,并用SP5 Leica共聚焦显微镜(配Leica Application Suite Software软件)观察结果。4.所有统计分析使用spss17.0软件(chicago,il,usa)进行,并且所有数据表示为均数±标准差(),使用单因素方差分析来分析多个组间的差异,通过使用tukey-kramer后测试或dunnett'st3分析两组之间的显著差异,以p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.成功构建了lyn+/+-16hbe细胞株、ctrl-16hbe细胞株、lyn-sirna-16hbe细胞株、sictrl-16hbe细胞株。2.在ctrl-16hbe细胞组中,免疫荧光法显示il-13可诱导增强muc5ac、bip、chop的表达,差异有统计学意义(p<0.05),且westernblot检测显示il-13诱导pi3kp85、akt1、nfκbp65相对磷酸化水平明显升高(p<0.05);在il-13诱导lyn+/+-16hbe细胞组与ctrl-16hbe细胞组中,免疫荧光法显示lyn高表达降低了il-13诱导的muc5ac、bip、chop表达(p<0.05),且westernblot显示lyn+/+-16hbe细胞组比ctrl-16hbe细胞组的pi3kp85、akt1、nfκbp65相对磷酸化水平明显降低(p<0.05)。3.westernblot检测nfκb在细胞核或细胞质中的表达情况显示,在ctrl-16hbe细胞组中,il-13降低细胞质提取物中的nfκbp65水平(p<0.05),但il-13增加细胞核提取物中的nfκbp65水平(p<0.05);在il-13诱导lyn+/+细胞组与ctrl-16hbe细胞组中,lyn高表达降低细胞核中nfκbp65水平(p<0.05)。4.在il-13刺激lyn-sirna-16hbe细胞组和sictrl-16hbe细胞组中,westernblot显示lyn-sirna-16hbe细胞的pi3kp85、akt1、nfκbp65的相对磷酸化水平明显升高(p<0.05),lyn-sirna-16hbe细胞中bip和chop的蛋白水平高于sictrl细胞,此外加入4-pba可同时降低sictrl-16hbe细胞和lyn-sirna-16hbe细胞bip和chop的表达;免疫荧光法显示lyn-sirna-16hbe细胞的MUC5AC、BIP、CHOP荧光强度明显增强(P<0.05)。在IL-13刺激的Lyn-siRNA-16HBE细胞组中,免疫荧光法显示4-PBA或PI-103明显降低Lyn-siRNA-16HBE细胞MUC5AC、BiP、CHOP的荧光强度(P<0.05);另外Western blot显示,PI-103降低Lyn-siRNA-16HBE细胞的Akt1、NFκB p65磷酸化水平(P<0.05),但是PI-103不抑制PI3K p85的磷酸化水平,4-PBA明显降低Lyn-siRNA-16HBE细胞的p-NFκB p65/NFκB p65水平(P<0.05),但是4-PBA不显著抑制p-PI3K p85/PI3K p85和p-Akt/Akt水平。结论:1.在Lyn高表达支气管上皮细胞中,Lyn激酶抑制IL-13诱导的内质网应激和MUC5AC,其涉及PI3K p85/Akt/NFκB途径。2.在Lyn低表达支气管上皮细胞中,内质网应激调节NFκB的活性,而不是调节PI3K p85/Akt的活性。3.在Lyn低表达支气管上皮细胞中,PI3K p85/Akt通路对IL-13诱导的内质网应激和黏液高分泌起着关键作用。4.Lyn激酶通过PI3K p85/Akt/NFκB信号途径抑制IL-13诱导的内质网应激从而减轻气道上皮细胞黏液高分泌。