人参2,3-氧化角鲨烯代谢途径中关键酶的表达调控研究

人参的主要药理活性成分为人参皂苷。研究表明，人参皂苷合成的前体物质为2,3－氧化角鲨烯，其主要代谢流向有两条，一条为合成皂苷类物质代谢途径（达玛烷型皂苷（dammarane-type ginsenosides），齐墩果烷型皂苷（oleanane-typeginsenosides）；另外一条是合成植物甾醇类物质，分别流向羊毛甾醇和环阿乔醇。在已报道的流向人参皂苷和植物甾醇两条支路中，达玛烯二醇合成酶（DS）是控制2,3-氧化角鲨烯流向人参皂苷合成途径的关键酶；环阿乔醇合成酶（CAS）控制2,3-氧化角鲨烯流向植物甾醇合成途径，本研究发现，在2,3-氧化角鲨烯流向植物甾醇合成途径中存在另一个关键酶——羊毛固醇合成酶（LAS），即，羊毛固醇合成酶（LAS）和环阿乔醇合成酶（CAS）共同控制2,3-氧化角鲨烯流向植物甾醇合成途径。由于人参栽培周期长，具有连作障碍，且容易受到病虫害干扰的缺点，本研究建立生长快速的人参发根无菌MS培养体系，并对人参发根提取物进行HPLC定量分析。 本研究通过RNA干扰技术分别调控人参发根中LAS、CAS和DS的表达，对人参皂苷生物合成途径中的关键酶基因LAS、CAS和DS进行功能鉴定，并在分子水平上调控人参皂苷的代谢途径，进而实现提高人参皂苷的含量。研究结果如下： 1.人参中存在2条植物甾醇合成途径，羊毛甾醇合成酶、环阿乔醇合成酶分别催化2，3-氧化角鲨烯产生植物甾醇合成前体（羊毛甾醇和环阿乔醇）。 2.建立适合于本研究人参发根继代培养体系，人参发根根尖的灭菌采用以2.0%NaClO灭菌90s，并以人参发根根尖1.0g/瓶，培养30d所形成的人参发根为本研究的植物试验材料。 3.分别选取LAS、DS和CAS基因的核心区域作为RNA干扰的siRNA片段，采用重组PCR两步法合成LAS、DS和CAS基因的RNAi元件；将RNAi元件与植物转化载体pBI121进行连接，得到含RNAi元件的重组质粒pBI121-LAS-RNAi、pBI121-DS-RNAi和pBI121-CAS-RNAi，并转化至发根农杆菌A4中；通过重组发根农杆菌转染新鲜的4年生人参根片外植体，从而成功诱导出分别含有LAS、DS和CAS基因相应RNAi载体的人参发根系。 4.通过检测人参对照组与LAS基因的RNAi载体转化组发根系中的总皂苷含量、单体皂苷Rg1、Re和Rb1含量、总甾醇的含量、羊毛甾醇的含量、达玛烯二醇的含量，以及环阿乔醇的含量，结果显示，LAS基因的RNAi载体转化组发根系中，LAS基因的表达受到明显的抑制，证明利用RNA干扰使基因沉默的方法切实可行；羊毛甾醇的含量和植物甾醇的含量同时受到显著的抑制，证明人参中存在羊毛甾醇合成酶催化2，3-氧化角鲨烯产生植物甾醇合成前体-羊毛甾醇的代谢流；人参总皂苷及单体皂苷的含量增加，即通过抑制羊毛甾醇合成酶的表达能够促进人参皂苷的合成。 5.通过检测人参对照组与DS基因的RNAi载体转化组发根系中的总皂苷含量、单体皂苷Rg1、Re和Rb1含量、总甾醇的含量、羊毛甾醇的含量、达玛烯二醇的含量，以及环阿乔醇的含量，结果显示，DS基因的RNAi载体转化组发根系中，达玛烯二醇含量、人参总皂苷和单体皂苷含量均受到明显的抑制，即DS基因是控制人参皂苷合成的关键酶基因；羊毛甾醇的含量、环阿乔醇和植物甾醇的含量均有显著提升，表明通过抑制达玛烯二醇合成酶的表达能够抑制人参皂苷的合成，并促进植物甾醇的合成。 6.通过检测人参发根对照组与LAS、DS、CAS基因相应的RNAi载体转化组人参发根系的总皂苷含量、单体皂苷Rg1、Re和Rb1含量、总甾醇的含量、羊毛甾醇的含量、达玛烯二醇的含量，以及环阿乔醇的含量，结果显示CAS基因的RNAi载体转化组发根系中，CAS基因的表达受到明显的抑制，即CAS基因的RNAi成功；人参总皂苷及单体皂苷的含量显著增加，表明通过抑制环阿乔醇合成酶的表达能够促进人参皂苷的合成。 7. RNAi使部分基因沉默，且对人参发根的外观形态不产生影响。 8.本研究分别获得人参皂苷含量提升54.93%的人参发根系和植物甾醇含量提升67.15%的人参发根系。