背景
糖尿病作为冠心病的等危症已经得到广泛共识,糖尿病患者的心血管风险显著增加。糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是由糖尿病引起的以左室舒张功能受损和心功能不全为主要表现的心肌病变,是糖尿病患者心力衰竭发生率高和死亡率高的主要原因。然而糖尿病性心肌病发生、发展的具体机制目前仍然不详,因而缺少以机制为基础的靶向性治疗。寻找糖尿病性心肌病发生、发展的具体机制并探索可能的有效治疗方法成为目前国内外研究的热点。
开展相应研究的首要问题是建立适宜开展糖尿病性心肌病研究的动物模型,而2型糖尿病动物模型的建立是前提。目前,建立2型糖尿病动物模型的方法主要有五种：一是遗传相关模型,即自发性糖尿病模型；二是通过敲除与代谢有关的基因联合高脂饮食喂养诱发2型糖尿病；三是化学药物损伤联合高脂饮食所诱发的2型糖尿病；四是胰腺部分切除；五是通过长期高脂饮食喂养诱发2型糖尿病。然而,这些建立动物模型的方法仍然存在部分不足：（1）遗传相关模型,由于遗传因素在其发病过程中起主导作用,不完全与临床相符,使其应用受到限制；（2）由于人类的2型糖尿病是多基因遗传病,现有的基因敲除模型不能完全模拟人类2型糖尿病,而且此模型不能排除代谢相关的基因敲除之后对后续基因干预的影响；（3）化学药物剂量过大或胰腺切除过多造成胰腺过度损伤会使血糖过高,而使动物模型倾向于1型糖尿病；（4）长期高脂饮食诱发的2型糖尿病动物模型的造模周期较长,且停用高脂饮食之后,血糖会逐渐恢复正常。
本课题针对2型糖尿病动物模型的上述不足,采用了高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素（streptozocin, STZ）诱导的2型糖尿病模型,通过监测体重、血压、血糖、血脂、糖耐量试验及胰岛素耐量试验的动态变化,并采用高分辨率显微超声技术监测糖尿病性心肌病发生和发展过程,探讨建立2型糖尿病性心肌病动物模型的可行性。
目的
1、探讨高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠动物模型的可行性；
2、探讨高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病性心肌病大鼠动物模型的可行性。
方法
1.选择5周龄健康雄性SD （Sprague Dawley）大鼠60只,体重120g±20g左右,购自山东中医药大学实验动物中心。行腹腔葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）及胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT）后随机分为4组：对照组（control组）、普通饮食STZ组（chow+streptozocin组）、高脂饮食组（high fat, HF组）和糖尿病组（diabetes mellitus, DM组）。Control组和chow+STZ组大鼠喂以基础饲料,主要组成为：20%粗蛋白,3%粗脂肪,3%粗纤维,其他74%（包括碳水化合物、微量元素等）。HF组和DM组大鼠喂以高糖高脂高热量饲料（北京华阜康生物有限公司提供）,主要成分为：34.5%脂肪、17.5%蛋白质、48%碳水化合物。4周后再次行IPGTT及IPITT, DM组大鼠出现胰岛素抵抗者给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）27.5mg/kg,同时chow+STZ组大鼠给予一次性腹腔注射STZ27.5mg/kgo Control组和HF组大鼠给予同等剂量枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。各组以原饲料继续喂养1周后,测定空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）和胰岛素（fasting insulin, FINS）,计算胰岛素敏感指数[ISI, ISI=In （FINS×FBG）-1]。连续两次空腹血糖≥11.1mmol/L,胰岛素敏感性减低且有多尿、多饮、多食现象的大鼠纳入实验。糖尿病成模后16周实施动物安乐死。
2.腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）及腹腔胰岛素耐量试验（IPITT）:大鼠禁食12h后行IPGTT,葡萄糖按1g/kg腹腔注射,于0、15、30、60及120分钟采集尾静脉血,使用强生One-Touch血糖仪测量血糖,并计算血糖曲线下面积（area under curve, AUC）。大鼠禁食4h后行IPITT,胰岛素按1unit/kg腹腔注射,余同IPGTT。
3.血液生化指标的测定：大鼠禁食12h后颈静脉取血,检测血清总胆固醇（Total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycercide, TG）、游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）,血糖（fasting blood glucose, FBG）和胰岛素（fasting insulin, FINS）,并计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index, ISI）。
4.血压及心率监测：应用BP-98A智能鼠尾无创血压计测定收缩压、舒张压、平均动脉压及心率；
5.超声心动图和血流动力学监测：采用二维、M超、脉冲多普勒和组织多普勒超声心动图技术以及超声背向散射技术,连续观察DCM发生和发展过程中左心室收缩和舒张功能变化；
6.应用心导管技术测定左室舒张末压（left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP）:大鼠深麻醉后,经右侧颈动脉插管至左心室,测量左室收缩压及舒张末期压力,监测2型DCM大鼠心室功能的改变。
结果
1、实验末各组大鼠的一般状况比较：
与对照组相比,普通饮食STZ组大鼠心脏重量/体重、饮水量、摄食量及尿量均明显增加（P<0.05）；与对照组相比,高脂组大鼠体重明显增加,心脏重量、饮水量均有所增加（P<0.05）；与对照组相比,糖尿病组大鼠心脏重量、心脏重量/体重、饮水量、摄食量、尿量及左室舒张末期压力均显著增加（P<0.01）；与普通饮食STZ组大鼠相比,糖尿病组大鼠心脏重量、饮水量、摄食量、尿量均明显增加（P<0.001）；与高脂组大鼠相比,糖尿病组大鼠饮水量、摄食量、尿量均显著增加（P<0.001）。
2、高脂4周各组大鼠腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）及胰岛素耐量试验（IPITT）结果：
（1） IPGTT结果分析：
与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPGTT试验15min、30min、60min、120min的血糖值均显著升高（P<0.05）；与普通饮食STZ组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPGTT试验60min、120min的血糖明显升高（P<0.05）；与对照组相比,高脂组大鼠在IPGTT试验15min、30min、60min、120min的血糖值明显升高（P<0.05）；与普通饮食STZ组大鼠相比,高脂组大鼠在IPGTT试验120min的血糖明显升高（P<0.05）。与对照组相比,高脂组及糖尿病组的血糖曲线下面积（area under curve, AUC）均明显增大（P<0.05）；与普通饮食STZ组大鼠相比,糖尿病组血糖曲线下面积（area under curve, AUC）均明显增大。
（2） IPITT结果分析：
与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPITT试验0min及15min的血糖值均显著升高（P<0.05）；与普通饮食STZ组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPITT试验15min及120min的血糖明显升高（P<0.05）；与对照组相比,高脂组大鼠在IPITT试验0mmin及15min的血糖值明显升高（P<0.05）；与普通饮食STZ组大鼠相比,高脂组大鼠在IPITT试验15min及120mmin的血糖明显升高（P<0.05）。与对照组相比,高脂组及糖尿病组的血糖曲线下面积（AUC）均明显增大（P<0.05）；与普通饮食STZ组大鼠相比,高脂组及糖尿病组血糖曲线下面积（AUC）均明显增大。
以上结果说明,高脂饮食4周后,高脂组及糖尿病组大鼠出现了明显的胰岛素抵抗。
3、糖尿病成模后12周各组大鼠腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）及胰岛素耐量试验（IPITT）结果：
（1） IPGTT结果分析：
与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPGTT试验15min的血糖值均显著升高（P<0.05）；与高脂组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPGTT试验120min的血糖明显升高（P<0.05）；与对照组相比,普通饮食STZ组大鼠在IPGTT试验30min及60min的血糖值明显升高（P<0.05）；与高脂组大鼠相比,普通饮食STZ组大鼠在IPGTT试验60mmin的血糖明显升高（P<0.05）。与对照组相比,普通饮食STZ组及糖尿病组的血糖曲线下面积（AUC）均明显增大（P<0.05）。
（2） IPITT结果分析：
与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPITT试验Omin、15min、30min、60min及120min的血糖值均显著升高（P<0.05～P<0.01）；与高脂组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPITT试验Omin、15min的血糖明显升高（P<0.05）；与对照组相比,普通饮食STZ组大鼠在IPITT试验15min、30min、60min及120min的血糖值明显升高（P<0.05～P<0.01）；与高脂组大鼠相比,普通饮食STZ组大鼠在IPITT试验60min及120mmin的血糖明显升高（P<0.05～P<0.01）。与对照组相比,高脂组及糖尿病组的血糖曲线下面积（AUC）均明显增大（P<0.05～P<0.01）；与高脂组大鼠相比,糖尿病组血糖曲线下面积（AUC）明显增大（P<0.05）。
4、实验末各组大鼠腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）及胰岛素耐量试验（IPITT）结果：
（1） IPGTT试验结果：
与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPGTT试验Omin、15min、30min、60min、120mmin的血糖值均显著升高（P<0.05）；与高脂组大鼠相比,糖尿病组大鼠在OGTT试验120min的血糖明显升高（P<0.05）；与对照组相比,普通饮食STZ组大鼠在OGTT试验60min、120min的血糖值明显升高（P<0.05）。与对照组相比,普通饮食STZ组、高脂组及糖尿病组的血糖曲线下面积（AUC）均明显增大（P<0.05）。
（2） IPITT试验结果：
与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPITT试验15min、60min的血糖值均明显升高（P<0.05）；与高脂组大鼠相比,糖尿病组大鼠在IPITT试验15min的血糖值明显升高（P<0.05）；与对照组相比,普通饮食STZ组大鼠在IPITT试验Omin、15min、30min、60min的血糖值明显升高（P<0.05）。与对照组相比,普通饮食STZ组、高脂组及糖尿病组的血糖曲线下面积（AUC）均明显增大（P<0.05）。
5、生化指标的测定：高脂饮食4周即STZ注射前,与对照组相比,高脂组及糖尿病组血清TG、FFA及FINS均明显升高（P<0.05）,ISI明显降低（P<0.05）,空腹血糖无显著变化,提示注射STZ前糖尿病组大鼠已存在胰岛素抵抗；STZ注射后一周,与对照组相比,普通饮食STZ组及糖尿病组FBG明显升高（P<0.05）,ISI显著降低（P<0.05）,高脂组及糖尿病组血清TG、FFA明显升高（P<0.05）,FINS无显著差异；糖尿病成模后6周,与对照组相比,糖尿病组FBG明显升高（P<0.05）,ISI显著降低（P<0.05）,糖尿病组血清TC、TG、FFA明显升高（P<0.05）,FINS无显著差异；糖尿病成模后12周,与对照组相比,糖尿病组血清TC、TG、FFA明显升高（P<0.05）,ISI显著降低（P<0.05）,FINS无显著差异；实验末,与对照组相比,糖尿病组血清TC、TG、FFA及FBG均显著升高（P<0.05）,ISI明显降低（P<0.05）。
以上结果提示,本研究以高脂饮食诱导联合小剂量链脲佐菌素注射建立的2型糖尿病动物模型,具有中度胰岛素抵抗,中度高血糖、高血脂等表现,基本符合2型糖尿病的临床特点。
6、血压及心率监测：实验过程中各组大鼠收缩压、舒张压及平均动脉压均无差异；实验末,与对照组及普通饮食STZ组相比,糖尿病组大鼠心率明显增快（P<0.05）。
7、超声心动图监测：
在糖尿病成模后6周,与对照组相比,糖尿病组E’/A’开始下降（P<0.05）；在糖尿病成模后12周,与对照组相比,糖尿病组LVEF和FS也开始受损（P<0.05）,且E’/A’下降更为明显。实验末与对照组大鼠相比,普通饮食STZ组大鼠舒张末期左室内径、室间隔厚度、左室后壁厚度、左室质量及左室容积均明显增加（P<0.05）,等容舒张时间、等容收缩时间及Tei指数均明显延长（P<0.001）,EF、FS及E’/A’均降低（P<0.05）；与对照组大鼠比较,高脂组大鼠舒张末期左室后壁厚度、左室质量有所增加（P<0.05）,等容舒张时间、等容收缩时间及Tei指数均明显延长（P<0.01）,E’/A’降低（P<0.05）；与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠舒张末期左室内径、室间隔厚度、左室后壁厚度、左室质量及左室容积均显著增加（P<0.05）,等容舒张时间、等容收缩时间及Tei指数均明显延长（P<0.001）,EF、FS及E’/A’均显著降低（P<0.05）；与高脂组大鼠相比,糖尿病组大鼠左室质量明显增加（P<0.05）,等容舒张时间、等容收缩时间明显延长（P<0.01）,FS有所降低（P<0.05）。超声背向散射积分结果显示,与对照组大鼠比较,糖尿病组大鼠室间隔、左室后壁及左室侧壁IB%均显著增加（P<0.05P<0.001）,CVIB显著降低（P<0.01～P<0.001）；与对照组大鼠相比,普通饮食STZ组大鼠室间隔及左室侧壁IB%明显增加（P<0.01～P<0.001）,室间隔、左室后壁及左室侧壁CVIB显著降低（P<0.05～P<0.001）；与高脂组相比,糖尿病组大鼠室间隔、左室后壁及左室侧壁IB%均显著增加（P<0.05～P<0.001）, CVIB明显降低（P<0.001）。
8、心电图检查：与对照组相比,糖尿病组大鼠出现了多种心电图异常。
9、血流动力学检测：与对照组相比,普通饮食STZ组大鼠左室舒张末期压力明显增加（P<0.001）；与对照组相比,高脂组大鼠左室舒张末期压力有所增加（P<0.05）；与对照组相比,糖尿病组左室舒张末期压力显著增加（P<0.001）。
结论
（1）高脂高热量饮食诱导联合小剂量链脲佐菌素注射建立的2型糖尿病动物模型,具有糖尿病状态稳定,中度胰岛素抵抗,中度高血糖、高血脂等表现,基本符合2型糖尿病的临床特点；
（2）高分辨显微超声技术可以无创性地监测2型糖尿病性心肌病的发生发展,2型糖尿病性心肌病大鼠以左室舒张功能障碍为主要表现,伴随有轻微的收缩功能异常；
（3）2型糖尿病大鼠模型的建模因素中没有不可干预因素,适于开展后续的糖尿病基因干预研究。
背景
糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是由糖尿病引起的以左室舒张功能受损和心功能不全为主要表现的心肌病变,是糖尿病患者心力衰竭发生率高和死亡率高的主要原因。自从1972年Ruber等首先提出DCM这一概念后,国内外学者在此领域中进行了大量的基础和临床研究。虽然临床研究显示,严格控制血糖可明显降低糖尿病微血管病变,但并未显著降低心血管事件的发生,糖尿病患者心力衰竭的发生率仍居高不下。因此,有必要对DCM的发生机制进行深入研究。
DCM发生的始动因素和关键环节是胰岛素抵抗（insulin resistance）。胰岛素抵抗通过抑制胰岛素信号传导和葡萄糖转运,降低心肌对葡萄糖的利用,使机体抑制脂肪分解的能力减弱,使血浆游离脂肪酸（FFA）和甘油三酯升高,而FFA可呈剂量依赖性地抑制细胞葡萄糖的转运和磷酸化作用,造成心肌能量代谢的异常,进一步加重胰岛素抵抗,造成恶性循环。胰岛素缺乏,能量代谢异常,酶系活性受抑导致心肌细胞核皱缩,线粒体肿胀及糖原沉积,形成DCM的病理基础。临床实验同时证实胰岛素抵抗与左室病理性重构和左室舒张功能障碍密切相关。但胰岛素抵抗与糖尿病性心肌病之间的深层链接机制尚不清楚,因此缺乏有针对性的治疗靶点。
TRBs基因是Groβhans等于2000年在果蝇体内新发现的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样蛋白基因家族,是抑制有丝分裂,诱导细胞凋亡的核基因,也被称为神经细胞死亡诱导蛋白激酶。人类TRBs家族包括TRB1、TRB2、TRB3,它们含有一个的相同的中心区,以及70-100氨基酸残基的N-末端和25个残基的C-末端区。果蝇TRB3是哺乳动物的同系物,因此,目前有关TRBs基因的研究主要集中在TRB3。TRB3具有广泛的生物活性,与糖脂代谢及胰岛素抵抗密切相关。研究发现,TRB3基因可以通过抑制Akt的功能影响胰岛素信号传导通路；TRB3是MAPK活性重要的调节蛋白,在MAPKK水平调控MAPK的磷酸化作用和活性,少量的TRB3增加即可显著增强ERK1/2和JNK活性,轻度抑制P38活性。但关于TRB3/MAPK信号通路的研究未见到后续的报道。
Akt和MAPK是选择性“胰岛素抵抗”两个关键通路,而且MAPK是调控心肌间质纤维化的关键信号分子。因此,我们推测在2型糖尿病状态下,胰岛素抵抗刺激TRB3过表达,并可能通过调控Akt及MAPK信号途径而影响DCM的发生和进展,但目前尚未见类似报道。据此,本课题拟通过2型DCM大鼠模型,研究TRB3在DCM发生、发展中的作用,并应用TRB3-siRNA特异性抑制2型糖尿病大鼠体内TRB3的表达,进而探讨TRB3基因沉默是否可以通过调控“胰岛素抵抗”相关信号通路从而起到改善DCM的作用。
目的
1.建立2型糖尿病性心肌病大鼠动物模型,探讨TRB3在2型糖尿病性心肌病发生、发展中的作用；
2.2型糖尿病大鼠体内转染TRB3腺病毒,观察2型糖尿病性心肌病的心脏结构和功能的变化；
3.在分子生物学、组织学和整体功能水平研究TRB3基因沉默改善2型糖尿病性心肌病的机制。
方法
1.pAdxsi-TRB3-shRNA病毒载体的构建：根据RNAi干扰技术原则,设计4对针对大鼠的TRB3基因的siRNA,经筛选后,选择沉默效率最高的序列构建pGenesil-1.2-TRB3-shRNA质粒,随后构建pShuttle-Basic-EGFP-TRB3-shRNA重组穿梭载体质粒,最后构建pAdxsi-GFP-TRB3-shRNA腺病毒载体。
2.选择健康雄性SD大鼠60只,体重120g±20g左右,购自山东中医药大学实验动物中心。行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）及胰岛素耐量试验（IPITT）后随机分为4组：对照组（control组）、普通饮食+链脲佐菌素组（chow+STZ组）、高脂组（HF组）、糖尿病组（DM组）。Control组和chow+STZ组大鼠喂以基础饲料,主要组成为：20%粗蛋白,3%粗脂肪,3%粗纤维,其他74%（包括碳水化合物、微量元素等）。HF组和DM组大鼠喂以高糖高脂高热量饲料（北京华阜康生物有限公司提供）,主要成分为：34.5%脂肪、17.5%蛋白质、48%碳水化合物。4周后再次行IPGTT及IPITT,DM组大鼠出现胰岛素抵抗者给予一次性腹腔注射STZ27.5mg/kg,同时chow+STZ组大鼠给予一次性腹腔注射STZ27.5mg/kg。Control组和HF组大鼠给予同等剂量枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。各组以原饲料继续喂养1周后,测定空腹血糖（FBG）和胰岛素（FINS）,计算胰岛素敏感指数[ISI, ISI=In （FINS×FBG）-1]。连续两次空腹血糖≥11.1mmol/L,胰岛素敏感性减低且有多尿、多饮、多食现象的大鼠纳入实验。糖尿病成模后16周实施动物安乐死,称取心脏重量,计算心脏重量/体重比值。
3.腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）及腹腔胰岛素耐量试验（IP ITT）:大鼠禁食12h后行IPGTT,葡萄糖按1g/kg腹腔注射,于0、15、30、60及120分钟采集尾静脉血,使用强生One-Touch血糖仪测量血糖,并计算血糖曲线下面积。大鼠禁食4h后行IPITT,胰岛素按1unit/kg腹腔注射,余同IPGTT。
4.血液生化指标的测定：大鼠禁食12h后颈静脉取血,检测血清总胆固醇（Total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycercide, TG）、游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）,皿糖（fasting blood glucose, FBG）和胰岛素（fasting insulin, FINS）,并计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index, ISI）。
5.超声心动图和血流动力学监测：采用二维、M超、脉冲多普勒和组织多普勒超声心动图技术以及超声背向散射技术,连续观察DCM发生和发展过程中左心室收缩和舒张功能变化；
6.应用心导管技术测定左室舒张末压：大鼠深麻醉后,经右侧颈动脉插管至左心室,测量左室收缩压及舒张末期压力,监测2型DCM大鼠心室功能的改变。
7.病理学检测：对左室心肌组织分别进行H&E染色、Masson染色、天狼猩红染色以及油红O染色,应用图象分析仪测定心肌细胞大小、胶原体积分数、管周胶原面积/管腔面积及心肌脂质含量。
8.心肌羟脯氨酸含量测定：将干燥至恒重的左室心肌组织称重后置于6NHCL中110℃水解16h,应用ELISA试剂盒测定水解物中羟脯氨酸的含量。因羟脯氨酸在胶原组织中占13.5%,所以最终结果显示为胶原含量（ug/mg左室干重）。
9.免疫组织化学染色：应用免疫组织化学染色法,光镜下观察心肌间质的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）及白介素6（IL-6）的分布情况。
10.实时定量RT-PCR检测：取新鲜左室心肌组织,Trizol法提取RNA,实时定量荧光RT-PCR技术检测TRB3、脑钠肽（brain natriuretic peptide, BNP）、TNF-α及IL-6的mRNA相对表达量。
11. Western blot检测：取新鲜左室心肌组织,提取蛋白,Western blot检测心肌组织内TRB3、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、TNF-α、IL-6及磷酸化及非磷酸化的ERK1/2、p38、JNK、 Akt的蛋白表达量。
12. TRB3-siRNA腺病毒体内转染实验：选择健康雄性SD大鼠60只（体重120g±20g左右）,随机分为HF+空载体组、HF+TRB3siRNA组、DM+空载体组、DM+TRB3siRNA组。糖尿病组造模过程同上。糖尿病成模后12周,HF+TRB3siRNA组、DM+TRB3siRNA组大鼠经颈静脉注射TRB3腺病毒,HF+空载体组及DM+空载体组注射pAdxsi空病毒载体,2周后补充注射一次,TRB3腺病毒注射4周后处死动物留取标本。
结果
1.2型糖尿病性心肌病大鼠模型的建立：
（1）实验末各组大鼠的一般状况比较：
与对照组相比,普通饮食STZ组大鼠心脏重量/体重、饮水量、摄食量、尿量及左室舒张末期压力均明显增加（P<0.05）；与对照组相比,高脂组大鼠体重明显增加,心脏重量、饮水量及左室舒张末期压力均有所增加（P<0.05）；与对照组相比,糖尿病组大鼠心脏重量、心脏重量/体重、饮水量、摄食量、尿量及左室舒张末期压力均显著增加（P<0.01）；与普通饮食STZ组大鼠相比,糖尿病组大鼠心脏重量、饮水量、摄食量...
