黄芪甲苷通过JNK信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎性损伤的保护作用机制研究

目的:通过建立体外高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型,研究黄芪甲苷(AS-IV)对高糖诱导HUVECs损伤的保护作用及其分子机制,为糖尿病及其并发症的防治提供实验依据与新思路。方法:1建立体外高糖损伤人脐静脉内皮细胞模型体外培养HUVECs细胞株,按培养基终末葡萄糖浓度不同,随机分为2组:正常对照组(葡萄糖浓度5.55 mM);高糖损伤组(葡萄糖浓度分别为11.1、22.2、33.3、44.4 mM),不同组之间用甘露醇平衡渗透压。各组分别培养时间24h、48h、72h后,光学倒置显微镜观察细胞形态学;MTT法检测细胞存活率;Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态。2黄芪甲苷对高糖诱导人脐静脉内皮细胞炎性损伤保护作用机制研究实验分为5组:正常对照组(葡萄糖浓度5.55 mM 48h);高糖模型组(葡萄糖浓度33.3 mM 48h);JNK抑制剂组(葡萄糖浓度33.3 mM 48h后加入JNK抑制剂SP600125浓度20μM);黄芪甲苷组(葡萄糖浓度33.3 mM 48h后加入黄芪甲苷浓度50μM);JNK抑制剂+黄芪甲苷组(葡萄糖浓度33.3 mM 48h后,JNK抑制剂SP600125浓度20μM预处理2h加入50μM黄芪甲苷),不同组之间用甘露醇平衡渗透压,相关处理后继续培养24h,收集细胞,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA法检测HUVECs上清液中TNF-α和IL-1β的含量;荧光定量PCR检测HUVECs中TNF-α和IL-1βmRNA表达量;Western blot法检测HUVECs中JNK、p-JNK、ASK1、p-ASK1、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平。结果:1体外高糖诱导人脐静脉内皮细胞伤模型的建立(1)不同浓度、不同时间葡萄糖对HUVEC形态学的影响结果显示:体外培养HUVECs细胞株,不同浓度葡萄糖培养24、48、72h后,正常对照组细胞贴壁生长,排列均匀,大小相似,呈卵石镶嵌状,边缘清晰,细胞间相互连接,细胞核呈圆形或椭圆形,位于细胞中央。高糖损伤组,随着葡萄糖浓度的增大,细胞形态发生明显的损伤,排列紊乱,大小不一,细胞核增大,长宽比、核浆比增高;当葡萄糖浓度大于33.3mM、培养时间超过48h,细胞出现不同程度的排列紊乱,肿胀变圆或梭形化,细胞膜边缘模糊不清,部分细胞胞膜不完整、损伤破裂,有片状脱落区形成。(2)不同时间、不同浓度葡萄糖对HUVECs细胞活力的影响结果显示:不同浓度葡萄糖培养HUVECs 24、48、72h后,随着葡萄糖浓度的逐渐增加,其细胞存活率逐渐降低,并呈现时间与浓度依赖性。(3)Hoechst 33258染色观察细胞凋亡结果显示:正常对照组细胞核质呈均匀黯淡的蓝色,核形状完整,染色质荧光表达均一,随着葡萄糖浓度增高部分细胞核呈现出浓缩碎块状,荧光表现为蓝白色致密浓染、少数细胞核可见核内染色质固缩出现凋亡小体,细胞凋亡损伤形态呈现葡萄糖浓度依赖性。2黄芪甲苷对高糖诱导的HUVECs细胞凋亡(1)不同浓度黄芪甲苷对细胞存活率影响结果显示:在一定浓度范围内随着浓度的升高,AS-IV对HUVECs具有促进增殖作用;当AS-IV的浓度为50u M时,其促进作用最显著(P<0.01),当AS-IV的浓度高于50u M时,其促进作用逐渐减弱。(2)AS-IV对高糖诱导HUVECs细胞凋亡的影响结果显示:高糖处理后HUVECs细胞,细胞核出现明显核固缩、溶解、碎裂等凋亡特征性表现。Hoechst33258染色HUVECs凋亡细胞形态,显示AS-IV能减少高糖诱导的细胞凋亡,流式细胞术进一步验证AS-IV对高糖诱导的HUVECs凋亡率的影响,其结果与Hoechst 33258染色结果一致。(3)AS-IV对高糖环境下HUVECs上清液中TNF-α和IL-1β含量的影响结果显示:与正常对照组比较,模型组细胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量显著升高(P<0.01)。黄芪甲苷组上清中TNF-α和IL-1β的含量与模型组比均显著下降(P<0.01)。(4)AS-IV对高糖诱导的HUVECs的TNF-α和IL-1βmRNA表达的影响结果显示:与正常对照组比较,高糖模型组HUVECs中TNF-α和IL-1β的mRNA表达量升高;与高糖模型组比较,黄芪甲苷组中TNF-α和IL-1β的mRNA上调倍数减小(P<0.01)。3黄芪甲苷通过JNK通路保护高糖诱导的HUVECs炎性损伤的机制研究Western Blot结果表明:与正常对照组比较,高糖模型组p-JNK、p-ASK1、Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3表达显著增多(P<0.01),Bcl-2表达显著降低(P<0.01),p-JNK/JNK、p-ASK1/ASK1、Bax/Bcl-2值增大(P<0.01);与高糖模型组比较,抑制剂组p-JNK、Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3表达降低(P<0.05或P<0.01),p-JNK/JNK、Bax/Bcl-2值减小;黄芪甲苷组p-JNK、p-ASK1、Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3表达降低(P<0.05或P<0.01),p-JNK/JNK、p-ASK1/ASK1、Bax/Bcl-2值减小(P<0.05或P<0.01);黄芪甲苷+抑制剂组与黄芪甲苷组结果一致;与抑制剂组比较,黄芪甲苷组p-JNK表达高于抑制剂组(P<0.01).结论:1高糖条件下,体外培养的HUVECs存活率降低、凋亡增加,并呈现时间与浓度依赖性。葡萄糖浓度33.3mM作用时间48h可能是HUVECs体外建立高糖损伤模型的合适实验条件。2高糖环境细胞存活率降低、凋亡增多,炎性细胞因子TNF-α和IL-1β基因表达及蛋白分泌增加,其机制可能与高糖激活HUVECs中JNK通路,促进细胞炎性反应,诱导细胞凋亡有关。3黄芪甲苷对高糖诱导的HUVECs具有保护作用,其机制可能是通过抑制JNK信号通路过度激活,减少细胞炎性反应,降低细胞凋亡有关。