除虫菊发状根的诱导及培养条件优化

除虫菊是一种具有杀虫活性的植物，其花中含有杀虫活性成分除虫菊素，是其具有杀虫活性的有效成分，由于除虫菊干花供应受环境条件的限制，故采用组织培养等生物技术手段生产除虫菊素是解决这一问题的有效途径。本研究用发根农杆菌ATCC15834和A4两种菌株侵染除虫菊外植体及其愈伤组织，获得除虫菊发状根，并对发状根培养条件进行优化，对除虫菊发状根和愈伤组织提取物进行生物活性测定，并对发状根提取物进行色谱检测，研究结果如下： 1.两种发根农杆菌A4和ATCC15834在MS和MS+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT培养基上对除虫菊叶片愈伤组织进行侵染，得到除虫菊发状根。发根农杆菌A4和ATCC15834均可诱导除虫菊愈伤组织形成发状根，但除虫菊愈伤组织对发根农杆菌A4更敏感，不添加激素的MS培养基更适宜除虫菊生成发状根。在无激素的MS培养基上用A4农杆菌侵染除虫菊叶片愈伤组织发状根的诱导率最高，达75%，ATCC15834次之，为63.89%，在添加激素的MS培养基上，用A4侵染除虫菊叶片愈伤组织发状根的诱导率为19.05%，ATCC15834侵染诱导率最低，为14.29%。PCR鉴定结果显示发根农杆菌含有的Ri T-DNA的rolB基因已整合进入除虫菊发状根基因组中。 2.选取除虫菊无菌苗的根、下胚轴和子叶3种不同的外植体，比较添加不同浓度的乙酰丁香酮的发状根诱导率，结果表明，不添加乙酰丁香酮时根的诱导率最高为100%，下胚轴和子叶的诱导率在乙酰丁香酮添加浓度为150μmol/L时最高。侵染前不同预培养时间也对外植体的诱导率有很大的影响，根和子叶均不需要预培养，下胚轴在预培养6d时诱导率最高，为对照的2.25倍。 3.以除虫菊发状根的增长量为指标，对发状根的培养基种类、培养基pH值、装液量及接种量进行优化。结果表明，在250mL的三角瓶中，除虫菊发状根培养的最佳培养基为MS培养基，pH为5.8，最佳装液量为50mL，每瓶最佳接种量为4～6g新鲜发状根。 4.对除虫菊发状根和愈伤组织提取物进行生物活性测定，浸虫浸叶法结果显示，除虫菊发状根丙酮提取物对三龄粘虫有较好的拒食活性和触杀活性，72h的校正死亡率高达79.99%；除虫菊愈伤组织提取物对三龄粘虫在短时间内有较好的毒杀活性，比较2种提取物的活性发现除虫菊发状根的生物活性优于愈伤组织。GC-MS检测结果显示，MS培养基培养的除虫菊发状根提取物中含有除虫菊素Ⅱ。