TLR9激动剂诱导肝癌细胞凋亡及其与TLR3激动剂的相互作用

目的 Toll like receptors (TLRs)是模式识别受体中的一个家族。到目前为止,人们已经发现了至少11种人类的TLRs。TLRs表达在多种免疫细胞上,尤其是抗原递呈细胞,如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞等等。大量的研究已经表明Toll样受体在天然免疫应答以及对抗微生物感染和组织损伤的适应性免疫应答中起着重要的作用。 因为TLRs在免疫应答中起着如此重要的作用,早期的研究都是立足于表达在免疫细胞上的TLRs的生物学功能和其重要性。然而,TLRs也表达在一些肿瘤细胞上,如黑色素瘤细胞、头部肿瘤以及结肠癌等都有表达。之前有研究表明,表达在肿瘤细胞上的TLRs对肿瘤的发生发展起着重要的作用。例如,人头颈部鳞癌细胞系上的TLR4被激活后能够促进肿瘤的发展,并保护肿瘤细胞逃避免疫系统攻击；而用鞭毛蛋白活化乳腺癌细胞的TLR5后能够抑制细胞增殖从而抑制肿瘤的生长。这表明不同的TLRs在肿瘤中发挥着不同的作用。因此,研究表达在肿瘤上的TLRs的功能是至关重要的。 肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,在中国由肝癌引起的死亡率位居第三,对人类健康和生存产生了巨大的威胁。因此,急需寻找一种更为有效的治疗肝癌的方法。TLRs在肝癌细胞上都有表达。有研究报道,肿瘤细胞上的TLR9活化能抑制细胞增殖促进细胞凋亡,有关TLR9激动剂对肝癌细胞的影响尚无报导；另外,TLR3激动剂poly I：C能促进肝癌细胞的凋亡,那么,TLR9激动剂与TLR3激动剂联合应用对肝癌细胞的作用亦无报导。因此,本文旨在探讨TLR9激动剂单独及TLR3和TLR9激动剂联合对肝癌的抗肿瘤作用。 方法 1. RT-PCR检测TLRs在肝癌细胞中的表达情况； 2.细胞转染：用Lipofectamine2000介导的方法将ODN M362Ctrl、ODN M362、 ODN2006-G5、polylI:C以及TLR9特异性siRNA转入HepG2和H7402细胞； 3.MTT法检测转染ODN M362Ctrl、ODN M362后细胞增殖情况； 4.流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期； 5.实时定量PCR检测细胞因子、受体及凋亡相关分子的基因表达； 6. Western Blot法检测RIG-I、NF-κB、p-NF-KB以及IκB-α的蛋白表达水平； 7.荧光检测细胞凋亡及siRNA或pEGFP-N1进入细胞的效率； 8.人肝癌细胞系HepG2细胞裸鼠皮下荷瘤； 9.瘤内注射TLR9激动剂治疗HCC 结果 1.TLR9激动剂能通过TLR9非依赖的途径诱导肝癌细胞凋亡 1.1TLR在肝癌细胞上的表达水平,除了TLR7、TLR8,其它的TLRs在三种肝癌细胞系中都有表达,TLR9的表达水平也较高； 1.2ODN M362及ODN M362Ctrl均能抑制人肝癌细胞增殖,对H7402细胞的抑制作用更为明显； 1.3ODN M362及ODN M362Ctrl对肝癌细胞周期无影响,但出现了明显的凋亡峰,提示ODN M362及ODN M362Ctrl诱导细胞凋亡 1.4ODN M362及ODN M362Ctrl能诱导肝癌细胞凋亡,对H7402细胞的促凋亡作用更为显著； 1.5ODN M362和ODN M362Ctrl能上调TLR9和炎性细胞因子TNF-α、IL-6、 IL-8、IFN-α、IFN-β的表达； 1.6ODN M362和ODN M362Ctrl对IKB-a及磷酸化的NFκB蛋白表达无影响,不能活化NFKB信号通路； 1.7沉默TLR9后,ODN M362和ODN M362Ctrl诱导的肝癌细胞的凋亡无变化,是TLR9非依赖的； 1.8转染ODN M362的H7402细胞在裸鼠体内无法成瘤,ODN M362抑制体内肿瘤的形成； 1.9ODN M362瘤内注射抑制体内肿瘤的生长。 2.硫代磷酸酯修饰的TLR9配体通过阻止TLR3配体的进入从而抑制其诱导的细胞凋亡 2.1TLR9激动剂ODN M362能够通过诱导人肝癌细胞凋亡抑制其增殖； 2.2在结肠癌细胞系中ODN M362也能削弱由polyI:C诱导的细胞凋亡； 2.3ODN M362能够下调识别polyI:C的受体RIG-I、MDA5、LGP2、TLR3的表达； 2.4ODN M362能够下调由polyI:C诱导的凋亡基因Noxa、puma等的表达； 2.5ODN M362能够下调由polyI:C诱导的炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、 IFN-α、IFN-β的表达； 2.6在结肠癌细胞系中ODN M362也能削弱由polyI:C诱导的细胞凋亡； 2.7硫代磷酸酯修饰的ODN M362Ctrl、ODN M362均能削弱polyI:C诱导的凋亡,而非硫代磷酸酯修饰的ODN2006-G5不能,CpG ODN阻断polyI:C诱导的凋亡依赖于其硫代磷酸酯的修饰； 2.8硫代磷酸酯修饰的CpG ODN抑制荧光标记的siRNA或pEGFP-N1进入细胞,硫代磷酸酯修饰的CpG ODN抑制polyI:C诱导的凋亡是通过阻断polyI:C的进入实现的； 2.9可以通过预先转染CpG ODN增强polyI:C的促凋亡作用。 结论 本研究发现,除了TLR7、TLR8,其它的TLRs在三种肝癌细胞系中都有表达,TLR9的表达水平也较高。TLR9配体ODN M362及其对照ODN M362Ctrl均能诱导细胞凋亡从而抑制细胞增殖；TLR9和促炎因子的表达也有所上调,但是不能活化NFκB信号通路。ODN M362能抑制肿瘤在体内的形成和生长。 本研究还发现,同时转染poly I:C和ODN M362相比poly I:C单独作用组细胞凋亡显著下降,同时识别poly I:C的受体、促炎因子以及凋亡相关分子也都显著下调。进一步的研究表明,这些效应是部分依赖于TLR9配体硫代磷酸酯修饰的结构,该结构阻止了polyI:C进入细胞。当预先转染CpG ODN再转染polyI:C, polyI:C诱导细胞凋亡的作用显著增强。这些结果提示我们,当TLR3和TLR9激动剂联合应用于肿瘤的治疗时,为避免硫代磷酸酯修饰的TLR9激动剂的阻止作用,polyI:C应在CpG ODN之后使用。该研究为临床合理、有效应用TLRs激动剂提供了有益的实验依据。