替米沙坦对异丙肾上腺素所致心肌肥厚大鼠中RASSF1A作用机制及影响

背景与目的 心肌肥厚是心肌细胞在机械压力和神经体液刺激下主要的病理生理反应。心肌肥厚通过使心肌细胞肥大、心肌细胞蛋白合成增加和细胞外基质增生以促进心脏做功,维持心脏的泵血功能。尽管在上述刺激的早期心肌肥厚被认为是心脏的代偿性反应,但在上述刺激的长期作用下心肌肥厚可促进正常心脏向心力衰竭演变。无论是对动物模型、还是对慢性肥厚性心肌病患者和高血压患者的研究中也表明控制心肌肥厚逆转左室肥厚对于阻断心力衰竭的发生至关重要。因此有关心肌肥厚的相关信号通路及通路中所涉及到的相关因子成为大家研究的焦点。目前研究发现Ras/Raf/ERK1/2信号调节通路与心肌肥厚的发生密切相关。 Ras是小G蛋白家族成员之一,通常情况下Ras以Ras-GDP的形式存在,但是在外界刺激的作用下转变为Ras-GTP,这是其活化状态。Ras-GTP可以催化下游因子从而组成完整信号通路。Raf是发现的首个Ras-GTP直接作用的下游因子,Raf可被Ras-GTP磷酸化。磷酸化Raf即p-Raf可通过级联反应磷酸化细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)1/2,磷酸化ERK1/2即p-ERK1/2可调节细胞质和细胞核内多种靶蛋白,这些靶蛋白涉及到心脏组织中各种生长反应包括心肌肥厚的发生。它们共同组成Ras/Raf/ERK1/2信号通路。Ras相关结构域家族基因1A (Ras effector Ras-association domain family1A, RASSFIA)是一个位于3P21.3染色体上的抑癌基因。研究提示RASSF1A可调节Ras-GTP的结构功能而影响Raf磷酸化。RASSF1A是Ras信号通路的效应因子。在肾上腺素诱导下RASSF1A过度表达心肌细胞中心肌肥厚反应较野生型心肌细胞相比明显减低,RASSF1A对心肌肥厚可能有负性调节作用,该作用可能与调节Ras/Raf/ERK1/2信号通路有关。 替米沙坦是一种血管紧张素受体拮抗(Angiotensin Ⅱ receptor blocker, ARB), ARB可以阻止血管紧张素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)与血管紧张素受体结合抑制心肌肥厚。Ang Ⅱ作为神经体液刺激中的一种,可以通过与其受体结合激活诸多信号通路促进心肌肥厚,这其中包括Ras/Raf/ERK1/2信号通路的激活。因此不排除ARB抑制心肌肥厚的机制之一是通过抑制Ras/Raf/ERK1/2信号通路而实现的。 本研究采用皮下注射异丙肾上腺素建立大鼠心肌肥厚模型,观察在大鼠肥厚心肌组织中RASSF1A、p-Raf和p-ERK1/2表达情况及其相关性,探讨RASSF1A在心肌肥厚中的作用,及替米沙坦在逆转心肌肥厚方面可能的机制,为逆转心肌肥厚治疗心力衰竭提供新的分子靶点。 方法 成年清洁级雌性SD大鼠30只,随机分为3组(每组10只)：对照组、模型组和干预组。除对照组外其余两组皮下注射异丙肾上腺素3mg/(kg·d)建立心肌肥厚模型,对照组皮下注射生理盐水6ml/(kg·d)作为对照。干预组予替米沙坦8.33mg/(kg·d)灌胃,对照组和模型组予等量蒸馏水灌胃。各组同时连续皮下注射和灌胃10天后运用生物信号系统测定大鼠血液动力学参数,计算大鼠心脏质量指数和左心室质量指数；取左心室心肌组织行HE染色,观察心肌组织形态学变化,MASSON染色观察心肌组织纤维化程度,计算心肌胶原纤维容积分数(CVF)；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心房利钠因子(ANF)及RASSF1A的mRNA相对含量,免疫组化方法观察RASSF1A、p-Raf和p-ERK1/2蛋白表达情况。以P<0.05为差异有统计学意义。 结果 1血液动力学变化 左室收缩压(LVSP)：模型组<干预组<对照组(130.55±5.73mmHg vs123.96±7.45mmHg vs145.93±6.83mmHg,均P<0.05)。左室舒张末压(LVEDP):模型组>干预组>对照组(6.63±0.32mmHg vs5.67±0.36mmHg vs4.49±0.36mmHg,均P<0.05)。左心室压力最大上升速率(+dp/dtmax)模型组<干预组<对照组(5681.04±92.19mmHg/s vs6237.42±37.50mmHg/s vs6723.09±82.78mmHg/s,均P<0.05)。左心室压力最大下降速率(-dp/dtmax)：模型组<干预组<对照组(4632.04±138.70mmHg/s vs4938.84±105.46mmHg/s vs5256.85±145.11mmHg/s,均P<0.05)。 2心脏质量指数和左心室质量指数测定 心脏质量指数(HW/BW):模型组>干预组>对照组(3.69±0.03mg/g vs3.44±0.01mg/g vs3.04±0.02mg/g,均P<0.05)。左心室质量指数(LVW/BW):模型组>干预组>对照组(2.82±0.09mg/g vs2.57±0.07mg/g vs2.31±0.01mg/g,均P<0.05)。 3HE染色 对照组心肌细胞排列规律整齐,模型组心肌细胞排列紊乱,有大量的心肌纤维增生并伴有炎性渗出,干预组介于对照组和模型组之间。 4MASSON染色和心肌胶原纤维容积分数(CVF) 模型组中在排列紊乱的心肌细胞间伴有大量的蓝染胶原纤维增生,而在对照组中看不到蓝染区域,干预组介于对照组和模型组之间。各组心肌胶原纤维容积分数显示模型组最高,干预组次之,对照组最低(28.43±5.25vs14.02±0.95vs4.27±0.84,均P<0.05)。 5逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) ANF mRNA相对含量模型组>干预组>对照组(1.60±0.18vs0.80±0.11vs1.03±0.23,均P<0.05)；RASSF1A mRNA相对含量模型组<干预组<对照组(0.77±0.11vs1.76±0.34vs1.15±0.25,均P<0.05)。 6免疫组化方法 模型组p-Raf阳性区域平均积分光密度明显高于对照组,干预组介于模型组与对照组之间(160.72±11.49vs115.94±4.06vs133.28±2.73,均P<0.05);模型组p-ERK1/2阳性区域平均积分光密度明显高于对照组,干预组介于模型组与对照组之间(154.23±4.02vs92.03±7.34vs129.24±3.49,均P<0.05);RASSF1A阳性区域平均积分光密度模型组含量低于对照组,干预组介于模型组和对照组之间(116.66±3.94vs168.29±7.49vs133.8±1.17,均P<0.05). 结论 1.大鼠肥厚心肌组织中p-Raf和p-ERK1/2表达升高,提示Ras/Raf/ERK1/2信号通路参与异丙肾上腺诱导的心肌肥厚的发生。 2.RASSF1A在异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚模型中低表达,同时p-Raf和p-ERK1/2高表达,提示RASSF1A是心肌肥厚的负性调节因子,该作用可能与Ras/Raf/ERK1/2信号通路有关。 3.替米沙坦干预组大鼠心肌组织中RASSF1A表达高于模型组,而p-Raf和p-ERK1/2表达低于模型组,提示替米沙坦抑制心肌肥厚的机制可能与促进RASSF1A表达、抑制Ras/Raf/ERK1/2信号通路有关。