目的本实验从网络药理学分析出发,预测乌梅丸能够治疗结直肠癌的潜在通路和机制。接着,通过体内外实验对乌梅丸及其核心单体的抗癌活性进行验证,并对其抑制结直肠癌细胞增殖的具体机制进一步探讨,为乌梅丸在结直肠癌临床治疗中的应用提供新的实验证据和理论基础。方法1.乌梅丸的网络药理学分析:首先从HIT和HERB数据库中获得乌梅丸活性成分的相关靶点;从Genecards和OMIM数据库中获得结直肠癌相关靶点。将上述两者靶点进行交集后获得的交集靶点进行PPI网络分析,筛选出“乌梅丸-结直肠癌”网络关系中的核心靶点。接着,通过对核心靶点进行GO/KEGG富集分析,预测出乌梅丸可能通过PD-L1/PD-1通路治疗结直肠癌。最后,通过CIBERSORT反卷积算法、TIMER算法评估基于PD-L1/PD-1通路乌梅丸治疗结直肠癌的潜在机制。2.乌梅丸体内药效的验证:通过构建结直肠癌小鼠移植瘤模型,对乌梅丸在体内抑制肿瘤生长能力进行验证。通过HE染色实验,检测乌梅丸对肝脏组织的影响。通过免疫组织化学法实验,检测乌梅丸对肿瘤组织中Ki67和PD-L1的表达水平的影响。通过流式细胞术实验,检测乌梅丸对肿瘤组织中浸润CD3+T、CD4+T及CD8+T细胞水平变化的影响。3.乌梅丸核心成分的药效及机制研究:基于网络药理学分析,筛选出乌梅丸的核心单体,分别是槲皮素、黄连素、白藜芦醇和咖啡酸。通过分子对接分析,虚拟预测4种单体分别与对应靶点的结合情况。通过细胞计数实验,对4种单体抑制结直肠癌细胞活力的能力进行验证。通过Western Blot实验检测PD-L1的蛋白表达情况,验证4种单体抑制结直肠癌细胞的作用机制。通过细胞计数和克隆形成实验,对咖啡酸抑制结直肠癌细胞生长与增殖的能力验证。通过Western Blot实验检测ERK1/2/p-ERK1/2的蛋白表达情况。通过细胞共培养实验,检测咖啡酸对脾淋巴细胞肿瘤杀伤能力的影响。结果1.网络药理学分析:利用HIT数据库和HERB数据库获取乌梅丸137种活性成分以及相对应309个直接作用靶点;利用Genecards数据库和OMIM数据库获取“结直肠癌”1841个相关靶点。通过EVenn在线分析工具构建韦恩图,获得乌梅丸与结直肠癌144个共同靶点。对144个交集靶点进行PPI分析,筛选出15个核心靶点。通过对15个核心靶点的GO/KEGG富集分析,发现其可富集于PD-L1/PD-1通路。接下来,基于TCGA等数据库分析结果显示,与正常组织相比,肿瘤浸润免疫细胞中M0巨噬细胞、CD8+T细胞和活化CD4+记忆T细胞在结直肠癌组织中占比相对较高;STAT3、MAPK3、MAPK1、AKT1、JUN、PTPN11、EGFR、MAPK14、NFKB1基因表达水平与免疫细胞的浸润水平呈显著正相关。因此,乌梅丸可能通过PD-L1/PD-1通路抑制结直肠癌的发生发展。2.乌梅丸体内药效验证:在体内实验中,结直肠癌荷瘤小鼠的肿瘤体积及重量随着乌梅丸的给药剂量的增加受到了显著地抑制,但小鼠体重无明显变化,即乌梅丸无明显毒副作用。另外,乌梅丸给药组的肝脏组织形态也无明显差异。在机制方面,乌梅丸给药组的肿瘤组织中Ki67和PD-L1的表达水平显著降低,肿瘤组织中CD3+T细胞的浸润水平呈上调趋势,说明乌梅丸可能通过下调PD-L1的表达而影响肿瘤微环境中CD3+T细胞的浸润水平,从而发挥抗结直肠癌的作用。3.乌梅丸核心成分的药效及机制研究:基于网络药理学分析结果,筛选出乌梅丸4种核心单体及其相关靶点,并验证了两者相互结合的作用。在药效方面,4种核心单体以剂量依赖方式抑制结直肠癌细胞的活力;其中咖啡酸显著抑制结直肠癌细胞的生长与增殖。在机制方面,PD-L1的蛋白表达水平随着给药剂量的增加而明显降低,说明4种单体能够调节PD-L1的表达。进一步实验证实p-ERK1/2的蛋白表达水平随着咖啡酸给药剂量的增加而显著降低,说明咖啡酸通过抑制ERK1/2的磷酸化而降低PD-L1的蛋白表达。另外,咖啡酸可增加脾淋巴细胞肿瘤杀伤能力和脾淋巴细胞的数量。结论乌梅丸及其核心成分通过抑制PD-L1/PD-1通路从而引起T细胞的激活,杀伤肿瘤细胞,发挥抗结直肠癌的作用。其中咖啡酸通过直接靶向ERK1/2而抑制ERK1/2的磷酸化水平,从而抑制PD-L1的表达和结直肠癌细胞的增殖。
