肝癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一,在世界范围内,其发病率呈现上升的趋势。肝癌的发生不仅与细胞的异常增殖有关,亦与细胞凋亡的失衡存在密切关系。大量研究发现黄酮类化合物具有抗肿瘤的作用,其机制主要是通过抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡和干预细胞信号转导途径中的蛋白激酶等。甘草素是一种从甘草中提取的一种二氢黄酮单体化合物。国内外研究报道甘草素具有多种生理活性作用,但有关甘草素抗肿瘤作用的研究报道甚少。因此,本课题拟观察甘草素对肿瘤细胞增殖的影响及诱导肿瘤细胞凋亡作用,并通过检测凋亡相关蛋白与酶活性的变化深入探讨甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的分子机理,为进一步研究甘草素的抗肿瘤作用机制提供科学依据。
第一部分甘草素抑制肿瘤细胞生长及诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究
目的:探讨甘草素(liquiritigenin)对两株肿瘤细胞生长的抑制作用及对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用的影响。方法:本研究采用体外培养人结肠癌Lovo细胞和人肝癌SMMC-7721细胞的方法,通过噻唑蓝(MTT)比色法观察甘草素对肿瘤细胞增殖的影响;Hoechst染色法和电镜观察甘草素诱导SMMC-7721细胞凋亡的形态变化;流式细胞仪检测甘草素诱导SMMC-7721细胞凋亡率的变化情况。结果:甘草素对Lovo结肠癌细胞作用24、48和72h时各剂量组出现生长抑制作用,其最高抑制率分别为15.4%、57.1%和84.7%;对SMMC-7721肝癌细胞作用24、48和72h时,各剂量组都已出现生长抑制作用,最高抑制率分别达到85.6%、94.2%和91.3%,并呈现明显的剂量-效应关系。甘草素0.4mM作用SMMC-7721细胞12、24、48和72h,Hoechst染色观察可见细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染;透射电镜观察可见0.4mM甘草素作用细胞72h后,细胞染色质浓缩、空泡。流式细胞仪检测结果发现,甘草素可诱导SMMC-7721细胞凋亡,并呈时间-剂量效应关系,甘草素剂量为0.6mM作用24h后,即可引起23.52%的细胞发生凋亡。结论:甘草素对人结肠癌Lovo细胞和人肝癌SMMC-7721细胞的生长均有抑制作用,其中对SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用更加明显,并能诱导SMMC-7721肝癌细胞细胞凋亡。
第二部分研究甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的氧化机制
目的:探讨甘草素诱导人SMMC-7721肝癌细胞凋亡作用的氧化机制。
方法:细胞经氧化敏感的荧光染料2,7-二氢二氯荧光素(DCFH)和罗丹明123(RH-1231)染色后,用流式细胞仪分别测定细胞内氧化水平(ROS)线粒体跨膜电位的变化;黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,5'5'-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法测定GSH和GSH-PX活性;通过免疫印迹法测定凋亡相关蛋白(p53、Bcl-2和survivin)的表达水平,采用酶标法检测caspase-3酶的活性。结果:0.4mM甘草素作用SMMC-7721细胞后出现ROS积聚,作用3h时,ROS已出现显著升高,并且呈现时间效应关系,作用9h达到最高峰;预先加入NAC作用30min后再加入甘草素,发现NAC可抑制细胞凋亡和细胞内ROS的产生;同时,随着作用时间的延长,线粒体膜电位不断下降,在作用9h和12h时出现显著下降;细胞内抗氧化酶SOD、GSH和GSH-PX活性均在甘草素作用后出现持续下降;0.4mM甘草素作用0、12、24、48和72h后,凋亡相关蛋白p53和Bcl-2表达水平分别呈时间依赖性上调和下调,survivin蛋白和procaspase-3表达下调,caspase-3活性上升。结论:甘草素诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的机制可能与其促氧化机制有关。
