鞘蕊苏二萜类生物合成机制与茅苍术根茎、叶基因表达差异研究

本论文由两部分组成,第一部分是鞘蕊苏二萜类生物合成机制,第二部分是苍术根茎、叶基因表达差异研究。第一部分:鞘蕊苏药材药用植物名为毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii(Wild)Briq),系唇形科(Labiatae)鞘蕊花属植物。野生毛喉鞘蕊花的发源地为印度次大陆,主要分布在印度、尼泊尔、缅甸、斯里兰卡、泰国等亚热带国家,我国云南会泽、东川等地有少量发现植物学家界定为稀有物种。民间将该中草药用于治疗哮喘、咳嗽、肿瘤等疾患,疗效显著。鉴于鞘蕊苏的独特疗效。湖北福人药业公司将其开发为“鞘蕊苏胶囊”中药新药,获得生产批件【批件号:2011S00365】。为了解决鞘蕊苏胶囊产业化所需原料药材的供求问题,湖北中医药大学刘焱文教授科研团队与湖北福人药业公司产学研结合,从云南会泽县移植鞘蕊苏至湖北通城规范化种植。本论文对鞘蕊苏5个二萜合成酶基因,即TPS1、TPS3、TPS4、TPS14和TPS15进行克隆,并且研究其其特异性表达,以期提鞘蕊苏药材二萜有效成分的含量,从而为通城种植鞘蕊苏药材培育优良种质提供了科学实验的依据。1以鞘蕊苏种子萌发2周左右的幼苗为试材,提取RNA并去除g DNA后反转录成c DNA,行成克隆模板。以二萜相关基因不同合成途径CPS和KS的保守区域设计引物,通过引物特异性PCR克隆出保守区域碱基片段,再通过3’RACE和5’RACE分别进行3’和5’端编码区全长的扩增,将测序结果进行拼接,利用拼接的引物设计基因全长扩增的引物,再次引物特异性PCR,最终得到基因的全长序列?2对Cf TPS14、Cf TPS15的CDS序列进行生物信息学分析。通过NCBI进行Blast X比对分析,Cf TPS14为映式贝壳杉烯合成酶,Cf TPS15为映式柯巴基焦磷酸合成酶。Cf TPS14等电点为5.38,分子式为C3987H6231N1073O1194S42,脂肪系数为91.35,主要平均疏水特性(GRAVY)为-0.189,表现为亲水性,细胞定位其分布在细胞膜外?Cf TPS15等电点为6.86,分子式为C3633H5629N993O1046S27,脂肪系数为87.65,主要平均疏水特性(GRAVY)为-0.371,表现为亲水性,细胞定位在细胞膜外?3针对测序得到的二萜相关基因保守区域碱基序列设计q PCR引物,设计原则为扩增长度:100-300 bp;引物长度:18±2;Tm值:54±1℃;引物自身没有发卡结构,引物之间不易形成二聚体结构。分析结果表明,Cf TPS1为柯巴基焦磷酸异构体合成酶,Cf TPS3、Cf TPS4为丹参酮二烯和13R泪柏醚合成酶,Cf TPS14为映式贝壳杉烯合成酶,Cf TPS15为映式柯巴基焦磷酸合成酶。Cf TPS1和Cf TPS3参与铁锈醇前体丹参酮的合成,故Cf TPS1和Cf TPS3主要在根和根茎中表达,茎中含量较少;Cf TPS3和Cf TPS4参与佛斯柯林前体13R泪柏醚的合成,因此Cf TPS3主要在根和根茎中表达,Cf TPS4可能参与其他催化过程,因此在花和叶中含量较高;Cf TPS14和Cf TPS15参与次霉素前体映式贝壳杉烯的合成,因此在花和叶中含量较高,在根中含量较低。上述研究表明,q PCR分析结果与基因特异性表达趋势基本一致。4以CfTPS15基因的CDS设计引物,并加入SalⅠ和NotI酶切位点,采用PCR技术扩增得到带有酶切位点的基因CDS序列,通过酶切位点将Cf TPS15与表载体Pet28a连接,并转化到大肠杆菌细胞BL21,再通过加入适当的诱导剂IPTG诱导Cf TPS15基因的蛋白表达?第二部分:茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.(Compositae菊科),是我国传统常用药材。茅苍术的根茎具有燥湿健脾、祛风散寒、明目等功效。主要有效成分为苍术素、β-桉叶醇、苍术醇和苍术酮等萜类化合物。由于市场对茅苍术的需求与日俱增,茅苍术野生资源受到掠夺性采挖,导致数量锐减。因此,人工种植已成为必由之路。而如何提高茅苍术根茎产量、保证药材质量是人工种植要解决的首要问题。尽管茅苍术的化学成分、药理学、生理生化、栽培技术等研究较多,根茎形成和生长的分子机制仍不清楚,很大一部分原因是缺乏茅苍术基因组信息。近年来发展的高通量转录组技术为茅苍术功能基因组研究提供了有效手段。1以江苏茅山的茅苍术为研究对象,对其根茎和叶的转录组进行测序。构建了茅苍术总RNA的c DN文库,采用Illumina Hi Seq2000平台对茅苍术的转录组进行了测序和从头组装。通过移除adaptor序列和低质量的读序后,分别从叶和根茎转录组得到118,397,448和152,688,850clean reads;总核苷酸数达33,885,787,250 bp(20 G),平均读序长度均为125 bp;在所有的茅苍术样品中共计有22,891条unigene表达,其中5,693条、4,502条、6,430条、3,504条和9,296条unigene分别在2份叶样品和3份根茎样品中表达。总共有39,664条序列(占所有unigene总数的42.90%)与nr数据库中已知的基因相匹配,这些数列中的26,159(28.32%)条unigene被归类到一个或多个GO项下。将unigene映射到KEGG数据库的参考代谢通路,总计10,504条unigene被注释,可归入289条KEGG代谢途径;161个Unigenes功能被注解为CYP450s,属于71 CYP家族类;92366个Unigenes中确定了10103个SSR,其中1074个Unigenes包含两个以上的微卫星D NA,而且406个SSR存在于复合形式。2茅苍术叶和根茎转录组的特异性表达分析。在叶和根茎中转录丰度高的(FPKM>1000)的基因分别有227条和105条,其中有47条在两种组织中共存。GO富集分析中,4,982DEGs映射到GO数据库中,共有262个GO项目明显富集。KEGG富集分析表明,1,158条上调的unigene与159条KEGG途径相关联,其中29条unigene归于植物激素信号传导(ko04075),而多数unigene与淀粉和糖代谢(ko00500)、内质网蛋白加工(ko04141)和氨基酸的生物合成(ko01230)相关。将茅苍术的测序结果与AGRIS数据库中比对,鉴别出42个转录因子家族;叶中共有60个转录子上调,根茎中共有67个转录子上调。3选择20个差异性表达基因(DEGs)的q PCR验证RNA测序和计算结果表明,所有选择的基因q PCR相对表达量和转录组分析具有相同的趋势。测试了这些基因的关系,发现它们之间有显著的正相关关系,相关系数达到0.81。4通过DEGs进一步分析参与根茎起始和发育的候选基因,鉴定了104个基因共同参与器官发育、激素生物合成和激素信号转导,其中包括一些转录因子(2个MADS盒蛋白,12个类AP2转录因子)。