葛根总黄酮联合三氧化二砷体外诱导NB4细胞凋亡的实验研究

[背景及目的]急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是一种特殊类型的急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia, AML),具有特征性的t(15；17)(q22；q21)易位及PML-RARa致病融合基因。APL发病时易伴发凝血紊乱、弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)导致重要脏器出血,早期死亡率高。近20多年来,全反式维甲酸(all-trans retinoid acid, ATRA)及三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO)成功诱导APL患者白血病细胞分化或凋亡使约90%左右的患者达到5年无病生存,使APL从不治成为真正意义上的可治。本课题组前期研究发现葛根有效活性成分—葛根总黄酮(Puerariae radix flavones, PRF)(25-200μg/ml)抑制APL细胞株NB4细胞的增殖,诱导细胞凋亡,与ATO具有协同作用。其作用机制与上调的FasL、Caspase8蛋白,Caspase 3蛋白表达,活化JNK,下调p38 MAPK有关。基于课题组上述研究结果,本课题以更低剂量PRF(10、30、50μg/ml)和/或联合1μM ATO体外诱导NB4细胞凋亡,探讨低剂量PRF联合ATO对NB4细胞增殖及凋亡的影响。 [方法]采用(0、10、30、50μg/ml)PRF联合1μM ATO处理NB4细胞24、48、72小时,MTT法检测细胞增殖抑制率；光学显微镜及荧光显微镜观察细胞形态改变；FITC-AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率；流式细胞仪检测细胞周期及线粒体跨膜电位变化；蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达变化。 [结果](10、30、50μg/ml)PRF单药及联合1μM ATO对NB4细胞株均有不同程度的增殖抑制作用,MTT法检测发现并随着浓度增加、作用时间的延长,抑制率逐渐升高,说明PRF可呈浓度及时间依赖性抑制细胞的增殖,ATO联合组比PRF单用组凋亡更显著,组内及组间具有统计学差异(p<0.01)。瑞氏染色发现随着PRF浓度增加,细胞数减少,形态大小不一,细胞碎裂崩解、核固缩逐渐明显,凋亡小体数量明显增加；DAPI染色见药物处理组细胞核数量减少,核皱缩碎裂崩解,出现新月形凋亡小体并且数量增加。AnnexinV+/PI-示单药组早期凋亡率随着浓度增加稍有增加,但未见统计学差异(p>0.05),联合组呈剂量依赖性增加,具有统计学差异(p<0.05)；各处理组细胞线粒体膜电位下降,但无统计学差异(p>0.05)；蛋白印迹法发现：PRF联合1μM ATO可上调NB4细胞中JNK表达。 [结论](10、30、50μg/ml)PRF单药、或联合1μM ATO均可诱导NB4细胞凋亡,且PRF与1μM ATO具有协同作用,其作用途径与活化JNK途径相关,与线粒体凋亡途径无直接相关。