四种植物病原真菌对多菌灵的抗药性分子遗传机制及其检测技术的研究

苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，同时也降低了对用药技术和用药时间的要求，提高了病害的防效。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用2～3年后许多植物病原真菌很快会出现抗药性问题。苯并咪唑类杀菌剂是通过与病原菌β-微管蛋白结合，抑制微管的功能，阻止细胞的有丝分裂，抑制病原菌生长。病原菌抗药性的产生是因为细胞中β-微管蛋白由于控制该蛋白的基因发生突变，使蛋白三维构象改变，从而失去了与药剂分子的亲和性。近年来大量研究证明，除引起马铃薯储藏期干腐病的Gibberella pulicaris外，β-微管蛋白基因的198或200位氨基酸密码子的点突变是导致大多数病原菌产生抗药性的主要原因。 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、禾谷镰孢霉（Fusarium graminearum）、炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiodies）和葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的多种作物炭疽病和灰霉病是中国常见的重要农作物和蔬菜病害。长期以来对这4种病害的防治主要采用苯并咪唑类或与不同作用机制药剂复配的杀菌剂。1987、1992和1996年在田间分别检测到B．cinerea、F．graminearum和S．sclerotiorum对多菌灵的抗药性菌株。 通过室内菌落直径法测定这四种植物病原真菌对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的敏感性。结果表明，小麦上F．graminearum的敏感菌株（MBCS）对多菌灵（MBC）的EC50值小于1μg／mL，无论是田间或诱导抗性菌株（MBCR）的EC50值均在10μg／mL左右，MBCR菌株与乙霉威（NPC）间不存在负交互抗药性。2002年采集、分离获得江苏省通州市4乡镇油菜上的223个S．sclerotiorum菌株，对MBC和NPC的敏感性测定得到2种表型，其中143个菌株表现对多菌灵敏感而对乙霉威高抗(MBCSNPCHR)，其余80个菌株表现对多菌灵高抗而对乙霉威敏感(MBCHRNPCS)，且MBCHRNPCS菌株对7～28℃温度范围不敏感。2002年采集、分离获得江苏省江阴市番茄上的14个B．cinerea菌株，对MBC和NPC的敏感性测定得到2种表型，其中2个菌株表现MBCSNPCHR，其余12个菌株表现MBCHRNPCS。2001年从江苏省盐城地区采集分离到辣椒上的17个C． 摘要 gloeosrorio苗e:菌株，其中l个、MBeH勺护es菌株、l个MBeL物PeR菌株和15 个MBesNPeHR菌株. 本研究通过根据其他相关真菌p一微管蛋白的保守序列合成的3对兼并性引 物扩增获得F名7aminearum、s.:cleroriorum、丑.。inerea与抗多菌灵相关的卜微管 蛋白全基因，通过其中的1对兼并性引物Bl和B3获得了c gloeosPoriodiesp- 微管蛋白基因的部分序列。其中F graminearum的口一微管蛋白基因全长163lbp， 包含3个内含子，编码447个氨基酸，与其他病原线状真菌除内元数目不同外， 具有高度同源性一氮基酸同源性达95.120/to99.3o%.5:clerotiorum的卜微管蛋 白基因全长1 685bp，包含4个内元，相应的编码447个氨基酸，氛基酸序列同源 性达95.78协97.66%.B.einerea的p一微管蛋白基因全长1765bp，包含6个内元， 相应的编码447个氛基酸，与s.:clerotio~和F graminearump一微管蛋白基因 的氨基酸序列同源性分别为97.76%和%20%.c sloeosPoriodies已撒管蛋白基 因的部分序列长586bp，包含1个内元（55bp），其位五与模式菌粗糙麦抱霉 （Ne urosPora crassa）的内元6一致.与Hsl（MBCs黑色炭疽）相比，炭疽菌中 的HGsZ（MBCs红色炭疽）、YCS（MBCLR）、YC41（MBCHR）:禾谷镰抱菌zF2054 （MBeR）:核盘菌Tz25（MBeHR）:灰葡萄抱eoyool（MBeHR）的同源性分别 为100%、97.18%、98.31%、98.87%、96.61%、98.87%. F graminearum的MBc”和MBc“菌株核普酸序列分析表明，MBC“菌株未 发生任何位点的突变，说明F graminearum对多菌灵的抗药性机制并非像其他丝 状真菌一样由口撒管蛋白198位氛基酸突变所致.5:clerotiorum、B.。inerea和 C sloeosPortodies的p一微管蛋白基因编码的 198位氛基酸残基的GAG谷孰酸 （Glu）突变为GCG丙氛酸（Ala）是导致上述病原菌产生对多菌灵高度杭药性 的主要原因;突变位点和突变类型与其他杭多菌灵真菌一致，且与乙霉威之间存 在明显负交互杭性.c sloeosPor勿die:的MBc咖Pc“菌株198位氛基酸未发生 突变，尽管对四种病原真菌7个菌株的p撒管蛋白进行比较发现，除198位氛基 酸外，其他位点也有所变化，那是属于菌株间的差异，但198位氮基酸的突变则 是导致田间病原真菌产生高度抗药性的直接原因. 为了快速、准确检测和监测s.sclero如~的田间杭药频率，根据MBCHR菌 株的点突变设计了2个快速检测方法:第一种方法别民据MBcHR菌株197和198 位密码子（GACGAG一GACGCG）形成八al酶切位点（3’CGCGS，），将BI瓜3 的扩增产物s74bp片段酶切成193bp和6slbP片段，而MBeS菌株的PeR产物不 被酶切;第二种方法用198位突变密码子作为3’末端碱基设计2对等位基因特 异性寡核普酸引物（ASO）用于“nested" PCR或直接从菌丝基因组DNA扩增. 引物对s一T侧55一1只能从MBcHR菌株中扩增出373饰的条带，而引物对s一Ts/ss一1 只能从MBcs菌株中扩增出373bp的条带.通过PcR扩增和T