藜芦人参配伍体内外成分变化与毒性的关联性研究

目的：中药“十八反”是中药配伍理论的重要组成部分，是中医长期临床实践的经验所得，在指导中药合理配伍使用，保证患者用药安全中一直发挥着重要作用。人参藜芦配伍是其中最具代表性的相反药对，以往的研究大都集中在对这种配伍增毒现象的确证上，而对产生这种现象的机理尚不十分清楚，特别是体内外毒性成分变化是否与配伍增毒密切相关尚未深入研究。因此，本研究分别从体外和体内两个层面研究人参藜芦配伍后成分变化，并与动物毒性变化进行关联，发现了一些人参藜芦配伍增毒的物质基础和体内过程的证据，对于科学认识中药“十八反”在中药复方中的配伍禁忌的规律，指导临床安全合理使用同类药物提供科学依据。 方法：本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技术，以藜芦的化学指纹图谱及其毒性成分辨识为切入点，从体外和体内两个层面研究人参藜芦配伍后成分变化，并与动物毒性变化进行关联，建立人参与藜芦配伍毒性评价体系，测定了人参与藜芦的半数致死量或最大耐受量，以及1：1配比时动物毒性实验以及合煎、合并液毒性差异。完成了人参藜芦配伍反药组合基于均匀设计和不同配比两种模型的急性毒性评价研究，从中发现了反与不反的配伍规律以及比较了两种模型在中药毒性评价中的优略。采用均匀设计对人参反藜芦各配伍药对进行了动物毒性实验，发现了某些特定比例下存在相反作用，并以此为线索进行了深入研究。在体内研究层面，首先确定了藜芦总生物碱经CYP酶代谢的亚型，并考察了经人参预处理的大鼠代谢藜芦总生物碱中主要成分的血药浓度差异，以期寻找人参藜芦配伍增毒的基于CYP酶的体内代谢证据。 结果：分别考察两味单药的急性毒性，藜芦的半数致死量为2.566g/kg,人参的最大耐受量大于80g/kg。两药1:1配伍时，合并液死亡率为35%，合煎液死亡率50%。合并液与合煎液毒性在藜芦与人参1:1配比时并未明显差异。设计2因素7水平均匀设计实验藜芦人参在1:2.63配比时合煎液的死亡率为70%，合并液死亡率为10%。在该配比的情况下有统计学差异。考察其物质基础的变化情况，在合并液与合煎液的物质成分研究的基础上，增加合并后再煎液组，结果显示芥芬胺可能是合煎过程中化学反导致其成分发生变化；计米亭碱、3-当归酰棋盘花胺和藜芦碱可能是在合煎过程中皂苷类成分增大了其溶出率。 固定藜芦剂量为2.566g/kg,将人参与藜芦不同配比（10：1～1：10）进行毒性实验，将人参剂量从0.2566g/kg到25.66g/kg逐步提高，小鼠死亡率呈下降趋势。人参与藜芦配伍时人参比例较小时毒性增大，物质成分分析显示藜芦毒性生物碱的溶出增加，存在相反增毒现象；随着人参比例增加毒性下降，物质成分分析显示生物碱含量呈下降趋势。提示配伍禁忌不是绝对的，与二者用量有密切关系，人参用量加时，可能还会有减毒作用。考察了煎煮30min、60min、90min、120min四个时间点生物碱的溶出情况，结果显示藜芦新碱的含量上升，介芬胺的两种衍生物的含量呈下降趋势。 首先提取藜芦中的总生物碱，并对其含量进行测定，介芬胺为21.82%，藜芦胺为24.60%。考察5种参与药物代谢的细胞色素P450亚酶，结果显示CYP1A2亚酶抑制剂的加入能明显抑制多种生物碱的代谢，而CYP2B1,CYP2D1,CYP2E1,CYP3A4抑制剂对生物碱的代谢抑制不明显，提示CYP1A2对藜芦总生物碱的代谢贡献率最大，是参与其代谢的主要亚酶。 大鼠按9倍临床最高剂量连续7天口服给药人参后，一次性腹腔注射临床最高剂量4.5倍总生物碱，通过测定生物碱的药代动力学变化，比较人参组与空白组之间藜芦总生物碱代谢差异，结果显示人参预处理组介芬胺和藜芦胺的AUC均高于空白组，有可能是体内配伍增毒的证据。 结论： 综上所诉，藜芦与人参在体外急性毒性与化学成分上存在配伍差异，毒性变化可能与配伍比例，煎煮方式，煎煮时间有关系，在动物体内藜芦的代谢可能与CYP1A2亚酶活性有关，人参连续给药后使藜芦中的毒性生物碱介芬胺、藜芦胺的代谢减慢，可能是其在体内积蓄中毒的重要原因。