目的本研究针对复杂性疾病类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA),选择临床治疗痹证的经典名方白虎加桂枝汤(Baihu-Guizhi decoction,BHGZD作为研究对象,开展全基因组表达谱芯片检测与网络药理学分析的整合研究,按照“BHGZD化学成分库的建立→候选靶标预测→“疾病基因-药物候选靶标”相互作用网络的建立和分析→BHGZD干预RA的关键网络靶标筛选及作用机制挖掘→实验验证”的研究路线,从“炎症-免疫”网络角度切入,初步鉴定该方的物质基础,揭示该方干预RA的作用机制并筛选其关键靶标。方法1.佐剂诱导性关节炎(Adjuvant-Induced Arthritis,AIA)动物模型的构建及BHGZD干预RA的药效学评价1.1 AIA动物模型的建立选用健康6～7周龄(体重200±20g)的雄性Lewis大鼠,每只大鼠尾根单次皮内注射0.1mL完全弗氏佐剂,建立AIA大鼠模型。1.2动物分组、给药及取材雄性Lewis大鼠54只,随机分为6组,分别为正常对照(Con)组(n=9)、AIA模型组(n=9)、低、中、高BHGZD干预组和甲氨蝶呤(MTX)干预组(n=6/组)。BHGZD三个给药剂量为5.4、10.7、21.4g·kg-1,分别相当于0.5、1、2倍临床等效剂量;甲氨喋呤给药剂量为0.2mg·kg-1,相当于临床等效剂量。大鼠给药容积按照1mL/100g体重灌胃,从免疫当天开始给药,BHGZD干预组每给药6天,间歇1天;甲氨蝶呤每给药3天,间歇1天;Con组和AIA模型组灌服等体积蒸馏水,各组动物给药至造模第25天。第26天处死动物,取关节、肝肾、滑膜等组织按操作要求进行处置。1.3关节炎评价对AIA大鼠关节炎严重程度、疼痛阈值、关节组织病理学变化进行检测和评价,明确该方对RA的干预效果。采用苏木素-伊红(HE)染色法分别对AIA大鼠肝脏组织和肾脏组织进行染色,镜下观察各组大鼠肝、肾受损情况,并计算肝、肾指数。2.全基因组表达谱芯片检测与网络药理学分析的整合研究2.1全基因组表达谱芯片检测及差异表达基因筛选采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒(Low Input Quick Amp Labeling Kit)提取大鼠关节滑膜组织的RNA样本,并用RNeasy mini kit纯化标记后的cRNA。采用全基因组表达谱芯片检测技术(Agilent Whole Rat Genome Microarray 4×44K),利用R软件中Limma包对芯片检测原始数据进行归一化,计算基因组间表达量差异倍数(Fold-change)及T检验(Student's t-test),以Fold Change≤0.5或Fold Change≥2,T-test P-value<0.05为标准,筛选AIA模型组与Con组大鼠关节滑膜组织之间的差异表达基因,获得AIA病相关基因集。。2.2 BHGZD化学成分库的建立用超高速液相色谱谱飞行时间质谱联用技术(ultra-fast liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry,UFLC-Q-TOF-MS/MS),对BHGZD 水液中化学成分进行鉴定;从台湾中医药资料库TCM Data base@Taiwan获取BHGZD五中药的化学成分信息。2.3 BHGZD所含化学成分的候选靶标预测于课题组前期建立的方法,预测BHGZDD含化学成分的候选靶标。2.4 RA相关分子-BHGZD候选靶标相互作用网络的构建和分析合相关数据库收集的RA相关分子信息及AIA发病相关基因,基于BHGZD所含中药及其相应候选靶标分子的相互作用,建立“RA相关分子-BHGZD候选靶标”相互作网络。算每个节点的网络拓扑特征值(节点连接度、节点介度和节点紧密度);筛选连接度大于所有节点连接度中位值两倍的节点,为网络中的hub节点,并进行直接相互作用络的构建;选取上述拓扑特征值均大于相应中位值的节点,为网络中的关键hub节点。得上述关键网络hub节点所参与的通路信息,通过统计学计算和通路富集分析,选与RA相关的通路。。3.BHGZD对预测信号轴的调控作用验证用蛋白印迹反应(western blot,WB)检测TLR4-c-Fos-IL2--TNF-α信号轴中TLR4(Toll-样受体 4,Toll-like receptor 4)、c-Fos/APP1(原癌基因,Fos proto-oncogene/AP-1 transcription factor subunit)、IL2(白介素2,,interleukin 2)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α,tumor necrosis factor-alpha)在AIA大鼠受累踝关节组织中的表达情况,并利用软件进行据分析。结果1.RA动物模型的成功建立及BHGZD干预RA的药效学评价AIA模型组大鼠红肿、畸形症状显著,即建模成功。BHGZD可有效缓解AIA大鼠关节炎严重程度、缓解疼痛、改善关节组织病理学改变,并在一定剂量范围内(5.4g·kg-1～21.4g·kg-1)呈现剂量依赖性(p<0.05、p<0.01或p<0.001)。AIA大鼠肝、肾组织HE染色结果,尚未观察到AIA大鼠模型建立及BHGZD给药造成的肝、肾损伤等病理变化。2.BHGZD干预RA相关“炎症-免疫”失衡网络的分子机制预测2.1 RA发病相关基因集的筛选基于全基因组表达谱芯片检测技术,得到26个AIA模型组与Con组大鼠关节滑膜组织之间的差异表达基因,其中9个上调基因,17个下调基因。2.2 RA疾病相关基因的收集和整理从Drugbank和KEGG数据库共收集到208个已知RA相关基因,与全基因组表达谱芯片检测所得26个AIA发病相关分子,去冗余后共得234个RA相关基因。2.3 BHGZD所含化学成分库的建立采用UFLC-Q-TOF-MS/MS分析技术,基于化学标准品、色谱行为、离子碎片以及质谱数据库(Natural Products HR-MS/MS Spectral Library)信息共鉴定出41种化合物,其中19种化学成分是依据化学标准品比对鉴定;从台湾中医药资料库TCM Database@Taiwan收集得到的123个BHGZD所含化学成分的二级结构。2.4 BHGZD所含化学成分的候选靶标基于BHGZD化学成分库,通过结构相似性和功能相似性原理,预测得到1312个候选靶标,来自桂枝、甘草、知母、石膏、粳米的预测靶标数目分别为545、701、197、424、266。其中含有53个已知干预RA的相关基因等。2.5 RA相关分子-BHGZD候选靶标相互作用网络的构建和分析基于BHGZD所含中药与其对应候选靶标的相互作用,建立“RA相关分子-BHGZD候选靶标”相互作用网络。基于String数据库,提取上述RA相关分子和BHGZD候选靶标的相互作用信息,并用string interaction score的中位数0.65为卡值,选取大于此卡值的相互作用信息;计算得到623个具有高连接度的hub节点,计算节点连接度、节点介度和节点紧密度,获得177个关键hub节点。在上述关键hub节点中,有39个是已知干预RA的相关基因,其中19个同时为BHGZD的候选靶标,如AGT、CCL5、CD40、CSF2、ESRI1、FOS、IFNG、IKBKB、IL110、IL1B、IL2、IL4、IL6、PPARG、PTGS2、PTK2B、TGFB11、TLR4和TNF。获得上述关键网络节点所参与的通路信息,通过统计学计算和通路富集分析,发现BHGZD干预RA的关键网络靶标显著参与Toll样受体信号通路、B细胞及T细胞受体信号通路、VEGF信号通路等RA“炎症-免疫”失衡相关通路,还显著富集于三条与肪酸代谢相关的通路,脂肪酸合成通路、碳水化合物消化吸收以及脂肪细胞因子信号通路。其中TLR4、c-Fos、IL2与TN F-α四个分子显著富集于Toll样受体信号通路和T细胞受体信号通路,且具有直接相互作用关系。3.BHGZD可抑制RA“炎症-免疫”失衡网络TLR4-c-Fos-IL2-TNF-α信号轴相关蛋白的异常高表达验证实验结果显示,与Con组相比,AIA模型组的大鼠受累踝关节组织中TLR4、c-Fos、IL2及TNF-α四种蛋白的表达均异常升高(均p<0.001),低、中、高剂量BHGZD均可下调此四种蛋白表达水平(p<0.05、p<0.01或p<0.001)。结论1本研究基于AIA大鼠模型,发现BHGZD可显著改善AIA大鼠关节红肿、畸变、疼痛等症状,明确BHGZD对RA的干预效果。2通过开展全基因组表达谱芯片检测和网络药理学分析的整合研究,筛选出显著参与RA“炎症-免疫”失衡网络调节的BHGZD的关键网络靶标,其中包括TLR4、c-Fos、IL2及TNF-α等显著富集于Toll样受体信号通路和T细胞受体信号通路的关键网络靶标。3通过实验验证表明,BHGZD可能是通过调控“炎症-免疫”失衡网络TLR4-c-Fos-IL2-TNF-α信号轴发挥干预RA的药效作用。4该方的关键网络靶标还显著富集于三条与肪酸代谢相关的通路,这可能与该方的寒药性有关。综上,本研究从“炎症-免疫”网络角度切入,初步揭示BHGZD干预RA的作用机制,为深入阐明该方治痹的科学内涵提供实验依据,为后续“病-证-方”结合研究奠定良好基础。
