PI3K/AKt信号通路在体外培养血管瘤内皮细胞中的表达及调控

目的：观察PI3Kp110催化亚基及p-Akt、Akt在体外培养血管瘤内皮细胞中的表达,并对其进行调控,探讨PIK/Akt信号通路在小儿血管瘤的发生、发展及消退过程中的作用。 方法： 1.用组织块结合酶消化法培养血管瘤内皮细胞,待长成单层细胞以后传代,建立血管瘤血管内皮细胞系,观察其增殖特征,绘制其生长曲线,并用第Ⅷ凝血因子相关抗原进行鉴定。 2.同步化培养血管瘤内皮细胞,采用Western blotting检测血管瘤内皮细胞PI3Kp110、p-Akt及Akt蛋白表达水平,同期用流式细胞仪检测血管瘤血管内皮细胞周期的分布及凋亡率,并分析PI3Kp110、p-Akt与Akt表达水平与血管瘤血管内皮细胞周期的分布及细胞凋亡的相关性。 3.待细胞处于对数生长期,换无血清培养液孵育48小时使细胞同步化,然后加入25μmol/LLY294002、1Onmol/L雷帕霉素、1.0g／L的曲安奈德继续孵育24小时,细胞刮刀收集细胞,检测体外培养血管瘤内皮细胞中PI3Kp110催化亚基、p-Akt及Akt的表达水平,同时检测血管瘤内皮细胞周期分布及细胞凋亡率,并分析p110、p-Akt及Akt的表达水平与体外培养血管瘤内皮细胞周期分布及凋亡的相关性。 结果： 1.培养的血管瘤内皮细胞于4-5天后开始贴壁生长,一周后只有少量细胞铺展贴壁生长,两周后开始分裂增殖,三周后细胞开始快速生长,四周后细胞铺满瓶底。用相差倒置显微镜观察,发现所分离的内皮细胞呈上皮细胞形态,部分呈环状排列,并有铺路石样外观。培养细胞第Ⅷ凝血因子相关抗原表达为阳性。 2.体外培养的血管瘤血管内皮细胞中有p110、p-Akt及Akt蛋白的表达。 3.LY294002、雷帕霉素干预24小时后,p110及p-Akt蛋白表达水平较对照组下降：对照组p110(0.37±0.04)、p-Akt(0.22±0.02)；干预组LY294002p110(0.19±0.01)、p-Akt(0.09±0.02),雷帕霉素p110(0.15±0.00)、p-Akt(0.09±0.00),与对照组比较,统计学差异均较大(P<0.01)；曲安奈德干预24小时后p110蛋白表达水平下降：p110(0.10±0.00),与对照组比较,统计学差异较大(P<0.01),而p-Akt蛋白未见表达；干预组细胞周期均阻滞于G0/G1期：对照组(60.88±6.23)%,LY294002(93.81±2.65)%、雷帕霉素(88.30.±3.66)%,曲安奈德(92.93±0.01)%,干预前后有统计学差异(P<0.05)；凋亡细胞总数增加：对照组(0.51±0.03)%,LY294002(11.24±2.34)%,雷帕霉素(14.40±1.77)%,曲安奈德(9.98±0.67)%,与对照组比较,统计学差异较大(P<0.01)。而总Akt蛋白表达水平无变化。 结论： 1.体外培养血管瘤内皮细胞中有PI3Kp110、p-Akt及Akt表达。 2. PI3K/Akt信号通路可能参与体外培养血管瘤内皮细胞凋亡的调控。 3.LY294002、雷帕霉素、曲安奈德可能通过干预PI3K/Akt信号通路中相应的靶点,抑制p110激活,阻碍Akt磷酸化,使体外培养血管瘤内皮细胞停滞于G0/G1期并诱导凋亡。