骨髓与脂肪间质干细胞分离与诱导分化为成骨细胞的研究

由疾病、外伤等原因造成的骨缺损及功能丧失的修复至今仍是骨外科领域尚 待解决的重大课题。组织工程这门新兴学科的兴起使骨缺损的修复和重建迈向了 一个新的时代。组织工程一个首要解决的关键问题是寻找来源丰富、易于操作的 的种子细胞。目前己发现人和动物骨髓中存在间质干细胞(Mesenchyma1 stem cells，MSCs)，它们是一群具有多向分化潜能的均质性细胞，在特定的诱导条件 下可分化为多种间质组织细胞，如骨、软骨、脂肪等细胞，以及多种非间质组织 细胞，如肌肉细胞、神经细胞等细胞类型。发育生物学家Verfaillie认为骨髓MSCs 在分化潜能上似乎可以与胚胎干细胞相媲美。在体外长期培养过程中，骨髓MSCs 始终保持其多向分化潜能，且遗传背景相当稳定，体内植入反应较弱，采用特定 诱导分化技术，将其定向诱导分化为成骨细胞，可以理想地解决骨组织工程中的 种子细胞问题。脂肪MSCs表现出与骨髓MSCs相似的、广泛的分化潜能等生物学 特性，而脂肪组织的获取比骨髓更容易、更安全。因此，脂肪MSCs将成为骨组织 工程中种子细胞的又一个更具吸引力的来源。 本研究以人胎儿骨髓和家兔脂肪MSCs为研究对象，目的在于建立起人胎儿骨 髓和家兔脂肪MSCs的分离培养及鉴定体系；在此基础上，研究不同浓度地塞米松 和人胚成骨细胞条件培养基对骨髓和脂肪MSCs向成骨细胞分化的影响，以期建立 一种优化的骨髓和脂肪MSCs向成骨细胞分化的体外诱导分化体系，为骨髓和脂肪 YSCs的临床应用提供理论依据和技术方法等。 ．本论文主要进行了五个方面的研究：1．人胎儿骨髓MSCs的生物学特性研究； 2．地塞米松对骨髓MSCs向成骨细胞分化的影响；3．条件培养基对骨髓MSCs向 成骨细胞分化的影响；4．家兔脂肪MSCs的分离培养及鉴定；5．地塞米松对脂肪 MSCs向成骨细胞分化的影响。得到以下结论： 1．采用全骨髓细胞贴壁筛选法分离得到人胎儿骨髓MSCs。人胎儿骨髓MSCs 不表达造血细胞表面抗原，如单核细胞／巨噬细胞表面抗原CDl4，造血前体细胞标志抗原CD34，白细胞标志抗原CD45，抗原呈递细胞或成纤维细胞表面抗原 HLA—DR；表达整和素家族成员CD29、粘附分子CD44，以及cDl05(endoglin)。人 胎儿骨髓MSCs具有多向分化潜能，可诱导分化为脂肪细胞、神经细胞和成骨细胞。 2．首次证明地塞米松浓度为lO-7mol／L时，更有利于促进人胎儿MSCs向成骨 细胞分化，同时，对人胎儿MSCs的抑制作用最小。 3．首次证明成骨细胞条件培养基促进人胎儿骨髓MSCs向成骨细胞分化。40％ 的条件培养基在诱导效率上与10-7m01／L地塞米松诱导效果较一致，但40％的条件培养基促进骨髓MSCs的增殖，又可显著增加ALP阳性率和钙化结节数，是诱导骨 髓MSCs向成骨细胞分化的较好方法。 4．首次采用O．1％胶原酶型I+1％BSA，消化90min的分离方法，从家兔腹股沟皮下脂肪组织，卵巢脂肪组织，或肾脏周围脂肪组织中分离得到脂肪MSCs。并证明与骨髓MSCs相似，家兔脂肪MSCs也不表达CDl4、 CD34、CD45、 HLA—DR，表达CD29、CD44以及CDl05；具有可分化为脂肪细胞、神经细胞和成骨细胞等细胞类型的多向分化潜能。 5．首次证明地塞米松浓度为10-8m01／L时，更有利于促进家兔脂肪MSCs向成 骨细胞分化，同时，对脂肪MSCs的抑制作用最小。 ‘