小鼠胚胎干细胞定向诱导分化成骨细胞研究

胚胎干细胞（ES细胞），是存在于早期胚胎内细胞团（ICM）的一种多潜能细胞。在体外抑制分化培养时，ES细胞可无限增殖并保持正常的二倍体核型，一旦撤除分化抑制因素，或添加适当诱导剂，ES细胞可发生谱系分化或定向分化。本研究在回顾ES细胞研究文献的基础上，进行了小鼠ES细胞的分离与克隆、ES-D3细胞系的扩增和分化能力检测，以及应用成骨细胞条件培养基、维生素C、β-磷酸甘油和地塞米松进行了定向诱导ES-D3细胞系向成骨细胞的分化。 1．MEF的分离与生长曲线 小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）在24孔培养板内以密度5.0×10～3/mL，每孔接种1mL，间隔2d或4d换液1次，细胞增殖缓慢，倍增时间（Td）分别为47.13和47.96h，细胞活力较差。以密度5.0×10～4／mL，每孔接种1mL，每间隔2d换液1次，MEF增殖较快，Td为53.12h，第2～3d时需及时传代，否则细胞易出现老化卷层，间隔4d换液时细胞增殖速度减慢，Td为57.80h。以密度2.0×10～4／mL，每孔接种1mL，间隔4d换液1次，MEF增殖速度快，Td为35.38h，第3～5d时传代较适宜，间隔2d换液时MEF增殖减慢，Td延长至41.56h。 2．丝裂霉素C对MEF的影响 MEF以密度3×10～4／mL接种24孔培养板，在24h后分别经10μg／mL丝裂霉素C处理30、90和180min。在培养的第3，5，7，9，11d时，MEF增殖抑制与未经丝裂霉素C处理比较，均存在极显著差异（P＜0.01），但三种不同的处理时间组间均无显著性差异（P＞0.05）。这说明，丝裂霉素C处理30min即可极显著抑制MEF的增殖，并可至少维持11d。 3．小鼠ES细胞的分离培养 应用MEF饲养层，以DMEM培养基添加15％FBS、10ng／mL rmLIF、0.1mmol／L2-Me、80U／mL青霉素、100U／mL链霉素，3.5dpc昆明系小鼠囊胚24h后脱去透明带，但极少有囊胚贴壁，48h时囊胚贴壁率为39％，72h贴壁率达74％，ES细胞集落形成率为8％，体外最高传5代。 4．ES-D3细胞系的扩增 以MEF为饲养层，DMEM培养基（含0.1mmol／L 2-Me+80U／mL青霉素+100U／mL链霉素）中添加15％KSR或15％FBS，，ES-D3细胞扩增培养48h时具有典型的集落形态，ES细胞增殖速度快，每天换液1次，间隔48h传代1次；添加15％NBS，维持ES细胞的有效增殖和存活效果较差，传第3代时消失。以STO细胞作饲养层，添加15％FBS，在倒置显微镜下观察，ES-D3细胞不易与周围的STO饲养层细胞区 别，形成的集落较平坦，生长状态不如MEF饲养层好。 5.ES一D3细胞系的自主分化 ES一D3细胞悬浮培养，24h后可聚集成小的细胞团，第2～3d时形成大量的类 胚体（EBs）。继续悬浮培养第6～8d时，EBs外围细胞开始脱落，延长悬浮培养时 间至第10d时EBs大量死亡。悬浮培养的ES细胞及EBs易贴壁生长，特别是培养 的第1Zd，贴壁细胞较多，用吸头轻轻吹打可使贴壁的细胞和EBs重新悬浮。悬 浮培养过程中未观察到囊状胚体的形成，但当EBs贴壁培养至第6d后出现囊状类 胚体。ES一D3源的EBs在贴壁培养第9一1 Od时出现神经样细胞、成纤维样细胞， 第14d时，EBs生长晕周围重新出现ES细胞集落，这些集落可存在较长时间。第 23d后出现典型的长扁平状血管内皮细胞，并可排列成索状且形成血管样结构，随 后血管内皮细胞逐渐消失。第3ld时，HE染色还显示存在一些多角形细胞。 6.小鼠成骨细胞条件培养基的制备 小鼠头顶骨经0.25%胰蛋白酶和0.04%EDI’A充分除去骨片周围及骨缝处的结 缔组织，再按常规植块法培养，骨片周围出现典型的成骨细胞的时间较早，原代培 养24h后即出现梭状、三角形或多边形细胞，BCIP加BT液体底物系统染色显淡蓝 紫色。随培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，8一IOd后相邻骨片间细胞汇合，密 度较大处呈现重叠生长现象。传代培养后细胞生长速度明显加快，3～4d即可铺满 皿底，差速豁附传代培养可获得较纯的成骨细胞。收集传代培养48h的成骨细胞培 养液，4000r/m离心20min，0.22娜滤膜过滤，可制得成骨细胞条件培养基。 7.Es一D3细胞系的成骨细胞诱导分化 在EBs单细胞贴壁培养的第14～2 ld，在DMEM培养基（15%FBS+0.1~of几 2一Me+80U/mL青霉素+looU/mL链霉素）中，添加60%成骨细胞条件培养基，第 22d时1%茜素红染色钙结节呈鲜红色，成骨细胞诱导形成率为 10.04%，与对照组 比较，差异极显著（P<0.01）。首次证明，条件培养液具有诱导ES细胞向成骨细胞 分化的作用。 添加50林创mL维生素C+50。比p一磷酸甘油，诱导分化的细胞分泌物形成 网状结构，茜素红染色阳性细胞分布在这些网状结构中，成骨细胞诱导形成率为 7.43%，与对照组比较差异显著（P<0.05）;添加50林留mL维生素C+50~ol几日- 磷酸甘油+1林mol/L地塞米松，茜素红染色阳性细胞分散而均匀，但未出现网状结 构，成骨细胞诱导形成率提高至27.57%，与对照组比较差异极显著（P<0.01），与 添加50林创mL_维生素C+50~ol几p一磷酸甘油比较，差异极显著（P<0.01）。在国 内，首次证明维生素C和p一磷酸甘油具有诱导ES细胞向成骨细胞分化的作用，地 塞米松能促进维生素C和p一磷酸甘油的这种诱导作用。