从原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞

采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养及传统饲养层培养方式，以高糖DMEM添加0.1mM2-巯基乙醇，犊牛血清，细胞因子为培养基，以4～13周龄屠宰牛胎儿为实验材料，探讨影响牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞的相关因素。实验结果如下： 1．共收集50例牛胎儿。在操作过程中，有10例污染；参与胚胎干细胞分离克隆的40例牛胎儿中，一体长6.5cm的雌性胎儿胚胎干细胞传到15代（从０代记起）。由牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞各代的形成率分别为：72.5%、47.5%、42.5%、30%、22.5%、17.5%、17.5%、12.5%、12.5％、10%、7.5%、5%、5%、5%、2.5%、2.5%。 2．牛胚胎干细胞分离与克隆时期的生长状况。牛原始生殖细胞培养12h时，就会出现4～5个原始生殖细胞组成的小集落。培养至第7天，出现典型鸟巢状胚胎干细胞集落。初次分离到的集落，可能因含杂细胞较多，一般呈黑色，褐色，多以山包状，馒头状等形态存在。随传代数的增多，呈典型鸟巢状的胚胎干细胞集落相对增多。 3．犊牛血清对牛胚胎干细胞分离克隆的影响。把细胞培养液中犊牛血清浓度分别设为：0%、5%、10%、15%、20%。结果发现：当犊牛血清为15%时效果最好。 4．细胞因子对牛胚胎干细胞分离克隆的影响。细胞因子添加与否对胚胎干细胞的分离及同源牛胎儿成纤维细胞的贴壁与生长影响并不显著。而在传代过程中有一定影响。其中以添加LIF+SCF+bFGF一组效果最好。在实验中，添加复合因子的牛胚胎干细胞平均最高传代数达7.0，未添加组为4.5。三种因子的添加量分别为1ng/ml；5ng/ml；10ng/ml。 5．消化液对牛胚胎干细胞克隆传代的作用。把细胞消化液浓度分别设为：0.2%胰酶；0.4%胰酶；0.04%EDTA；0.08%EDTA；0.2%胰酶+0.04％EDTA；0.4%胰酶+0.08%EDTA。其中以0.2%胰酶+0.04％EDTA为最好。对细胞综合损伤力小，且传代后胚胎干细胞的克隆能力也较高。 6．不同饲养层对牛胚胎干细胞分离传代的影响。与同源胎儿成纤维细胞共培养，以及分别以经过丝裂霉素灭活过的胎牛肌肉成纤维细胞、胎牛睾丸成纤维细胞、小鼠胎儿成纤维细胞、人胎儿成纤维细胞为饲养层比较，结果表明：以同源胎儿成纤维细胞共培养的方式效果最佳。 7．分离得到的牛胚胎干细胞，经碱性磷酸酶染色，体外分化实验，核型分析及细胞核移植实验证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。