保加利亚乳杆菌胞外多糖诱导人胃癌细胞凋亡的作用与机制

乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物。正是因为乳酸菌胞外多糖具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡等有益的保健作用，才会掀起广大学者对其生理功能，尤其是抗肿瘤活性研究的浓厚兴趣。 本研究以保加利亚乳杆菌胞外多糖（Exopolysaccharide produced by Lactobacillusdelbruecckii ssp. bulgaricus, L. b. EPS）为研究对象，分别采用MTT比色法、Giemsa染色法、透射电镜技术、琼脂糖凝胶电泳技术、原位末端标记法（TUNEL）、流式细胞术、免疫细胞化学技术及实时定量-PCR技术等从L. b. EPS对人胃癌SGC-7901细胞生长的抑制作用、L. b. EPS对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的诱导作用，及L. b. EPS对凋亡关键基因及蛋白表达的调控作用等三方面研究L. b. EPS诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用与机制，为进一步研究L.b.EPS抑癌和诱导肿瘤细胞凋亡的机理提供试验依据。 本研究得到的结果如下： （1） L.b.EPS对人胃癌SGC-7901细胞生长具有抑制作用。 MTT比色法研究发现，L.b.EPS在10mg·mL-1、40mg·mL-1的浓度下作用24h，细胞生长均受到不同程度的抑制，这一抑制作用随L.b.EPS浓度的升高而增强。并且浓度与生长抑制率呈现明显的依赖效应，40mg·mL-1试验组抑制率达73.81％；同时，L.b.EPS在10mg·mL-1～40mg·mL-1的浓度范围内，这一抑制作用随L.b.EPS作用时间的延长而增强。时间与生长抑制率也呈现出依赖效应，10mg·mL-1试验组抑制率从24h的52.28％提高到72h的65.37％。 （2） L.b.EPS能诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡。 Giemsa染色法结果显示，胃癌SGC-7901细胞经40mg·mL-1L.b.EPS作用24h后细胞逐渐变圆，体积缩小，胞浆浓缩，胞核着色较深且固缩碎裂，胞膜表面有芽状突起（凋亡前期状态），显示出较为典型的凋亡症状和趋势。透射电镜结果发现，经40mg·mL-1 L.b.EPS作用24h的SGC-7901细胞，细胞核缩小，其形态扭曲并出现断裂，且结构不完整，呈碎裂状，染色质凝集成不规则团簇，核仁消失，细胞浆普遍出现空泡，对照组核膜与细胞膜仍保持完整，核内染色质分布均匀。琼脂糖凝胶电泳结果显示，只有20mg·mL-1 L.b.EPS作用24h的SGC-7901细胞提取DNA后，在凝胶上形成较为明显的梯状谱带，其他浓度未出现梯状谱带。TUNEL结果发现，随着L.b.EPS浓度(10mg·mL-1，20mg·mL-1，40mg·mL-1)的增加，SGC-7901细胞的胞核区域的阳性细胞比率逐渐增加，多糖组凋亡指数显著高于空白对照组的凋亡指数，多糖高剂量组(40 mg·mL-1)作用24h后，凋亡指数可达9.84％。流式细胞术结果显示，L.b.EPS呈剂量依赖性地诱导SGC-7901细胞凋亡，40 mg·mL-1的L.b.EPS促凋亡作用最为明显，细胞凋亡率可达到8.6％。同时L.b.EPS也呈时间依赖性地诱导SGC-7901细胞凋亡，同时伴有细胞的坏死，其中10 mg·mL-1作用72h的L.b.EPS对SGC-7901细胞的促凋亡作用最为明显，细胞凋亡率可达到4.2％。 （3）L.b.EPS对凋亡关键基因及蛋白表达具有调控作用。 免疫细胞化学和实时定量-PCR结果显示，在体外条件下，L.b．EPS可在mRNA水平和蛋白水平下调胃癌细胞bcl-2基因的表达而上调bax基因的表达，诱发胃癌细胞发生凋亡。 由上述结果得到以下结论：体外检测表明，L.b.EPS对人胃癌SGC-7901细胞具有诱导细胞凋亡的效应。并且bcl-2和bax在L.b.EPS诱导SGC-7901细胞产生细胞凋亡的过程中，其蛋白／基因表达量分别出现下调和上调的趋势，提示bcl-2和bax在L.b.EPS引起胃癌SGC-7901细胞产生细胞凋亡效应的过程中，可通过凋亡信号转导途径产生致凋亡效应。