5氟脲嘧啶关节腔内注射治疗兔膝骨性关节炎的实验研究

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是影响人类健康最常见的关节疾患之一，人群发病率约为2％-6％，是导致50岁以上人群功能残疾、造成经济损失和影响社会发展的主要疾病之一。骨性关节炎伴随的滑膜炎症是软骨基质降解产物引起的继发性改变，滑膜炎症导致IL-1分泌增多，进一步导致金属蛋白酶分泌增多及活性增高，从而引发软骨的破坏。正常的滑膜细胞只产生微量的IL-1，OA时因脱落关节软骨碎片等刺激，B型滑膜细胞的生物学活性提高、大量增殖并分泌细胞因子，是OA时细胞因子的主要来源。分泌的大量IL-1又可刺激滑膜增生，增加细胞因子分泌，进一步加重OA病变的进展。正是在这样的研究背景下，我们认为滑膜的过度反应性炎症造成了内环境的失调，从而导致一系列的病理生理改变，如果控制滑膜的炎性增生，就能使分泌的有害细胞因子数量明显下降，打断恶性循环从而延缓软骨退行性变的发展。我们选用抗代谢类细胞毒性药物5氟脲嘧啶(Flurouracil，5Fu)，关节腔内注射作用于增生的滑膜细胞，抑制其合成DNA而终止有丝分裂，从而抑制炎性增生来控制炎症，使滑膜细胞的数量不因炎症而过度增加，因此减少炎性介质IL-1、IL-6、TNFα等的分泌，减少MMPs的诱导和生成，从而减轻和缓解对软骨的破坏。为探讨5Fu治疗骨性关节炎的效果，我们进行了以下五部分的实验研究： 一、兔膝关节伸直固定建立骨性关节炎动物模型。 目的：观察膝关节伸直固定后兔股骨髁关节软骨和滑膜的病理改变，为应用此模型进行OA防治研究提供试验依据。方法：兔子10只，左膝关节伸直固定，对侧膝关节不做任何处理做自身对照。六周后去除固定处死，观察双侧膝关节股骨髁关节面的大体改变以及股骨髁软骨和滑膜组织的病理变化，比较软骨Mankin’s评分及关节液中IL-1的浓度。结果：左膝关节软骨面颜色暗淡，股骨内髁负重处软骨有少量缺损；镜下见软骨层变薄，细胞减少、杂乱，基质蛋白多糖染色减退。滑膜充血、水肿、增厚，滑膜内膜层细胞约为3-5层，细胞呈水肿状态，内膜下层细胞数量增加，明显见纤维组织大量增生并侵入滑膜下层，少量巨噬细胞、淋巴细胞浸润。大体评分及Markin’s评分P值＜0.01，关节液IL-1浓度升高(P＜0.05)。结论：兔膝关节伸直固定6周后，股骨髁软骨和滑膜的病理改变符合OA的病理变化，可以作为OA治疗研究的动物模型。 二、5Fu关节腔内注射治疗兔膝骨性关节炎的药物剂量选择 目的：根据不同剂量5Fu关节腔内注射治疗兔膝骨性关节炎的疗效，选择适合的治疗剂量。方法：32只兔子制成骨关节炎模型动物后分成1mg／kg组、2mg／kg组、4mg／kg组和对照组四组。分别给与5Fu1mg／kg、2mg／kg、4mg／kg和生理盐水关节腔内注射，每周一次连续四次，最后一次治疗后一周处死。观察股骨髁关节面的大体改变以及股骨髁软骨和滑膜组织的病理变化，比较软骨Mankin’s评分及关节液中IL-1的浓度。结果：对照组软骨缺损程度较其它三组高(P＜0.01)，1mg／kg组软骨缺损程度较2mg／kg组和4mg／kg组高(P＜0.05)，2mg／kg组和4mg／kg组软骨损伤程度相似(P＞0.05)。滑膜表现与软骨相似。对照组关节液中IL-1浓度较其它三组高(P＜0.01)，1mg／kg组关节液中IL-1浓度较2mg／kg组和4mg／kg组高(P＜0.05)，2mg／kg组和4mg／kg组关节液中IL-1浓度相似(P＞0.05)。结论：2mg组和4mg组治疗效果相似(P＞0.05)，好于1mg组(P＜0.05)，所以选择2mg／kg作为治疗剂量。 三、5Fu关节腔内注射治疗兔膝骨性关节炎的毒副作用研究 目的：评价5Fu膝关节腔内注射治疗兔骨性关节炎的局部和全身毒副作用。 方法：24只兔子，其中16只制成骨关节炎模型动物后分成5Fu组和对照组，另外8只作为正常毒性组。5Fu组患膝和正常毒性组左膝关节腔内注射5Fu2mg／kg，对照组注射等量生理盐水，每周一次连续四次，最后一次治疗后一周处死。治疗前后进行血液学检测，处死后取主要脏器肝、肾、肺、心、脾和膝关节行组织病理学观察。结果：治疗前后兔全身情况、血液学参数、血液生化指标均无明显差异。主要脏器组织学检查未见病理性改变。关节的局部结构交叉韧带和半月板未见病理性改变，5Fu组关节软骨和滑膜的病理改变与对照组相比改善，正常组关节软骨和滑膜未见病理性改变。结论：5Fu膝关节腔内注射剂量为2mg／kg时，局部及全身未见明显毒副作用，安全可靠。 四、5Fu关节腔内注射治疗兔膝骨性关节炎的疗效观察 目的：评价5氟脲嘧啶关节腔内注射治疗兔膝骨性关节炎的疗效。方法：24只兔子制成骨关节炎模型动物后随机分成OA组、5Fu组和对照组三组，OA组立即处死，5Fu组按2mg／kg5Fu关节腔内注射，每周一次连续四次，对照组注射等量的生理盐水，最后一次治疗后一周处死。观察三组滑膜组织的光镜、电镜改变及软骨的光镜、MMP-1免疫组化改变，比较软骨Mankin’s评分及关节液、血液中IL-1的浓度。结果：5Fu组可见软骨破坏减轻，滑膜炎症明显抑制，Mankin’s评分有明显改善(P＜0.01)；血、膝关节滑液IL-1浓度降低(P＜0.05)，关节软骨中MMP-1表达明显减弱。电镜下见滑膜A、B细胞恢复正常功能状态。结论：5Fu关节腔内注射能抑制滑膜炎症，减少关节内有害细胞因子数量，缓解对软骨的破坏。 五、5Fu、透明质酸和激素关节腔内注射治疗兔膝骨性关节炎的对比研究 目的：通过对5氟脲嘧啶、透明质酸钠和激素三种药物关节腔内注射治疗兔膝骨性关节炎的疗效比较，客观评价5Fu的疗效。方法：32只兔子骨关节炎造模后随机分为5Fu组、SH组、TA组和对照组四组，分别给予5Fu、SH、TA、生理盐水关节腔内注射，每周一次连续四次，最后一次治疗后一周处死。观察软骨和滑膜组织的光镜改变及MMP-1免疫组化改变，比较大体观察评分和软骨Mankin’s评分及关节液中IL-1的浓度。结果：大体、光镜观察和Markin’s评分显示5Fu组、SH组和TA组三组软骨破坏较对照组有改善，5Fu组优于SH组和TA组，SH组与TA组之间没有明显差异。滑膜组织光镜观察示滑膜炎症5Fu组最轻，SH组和TA组其次，对照组最重；关节液IL-1的浓度和MMP-1表达与软骨破坏程度呈正相关，5Fu组IL-1浓度最低且MMP-1表达最少，SH组和TA组其次，对照组IL-1浓度最高且MMP-1表达最多。结论：5Fu、SH、TA都有改善软骨破坏的作用，但5Fu比SH、TA的疗效更好，更可靠。 上述5部分研究结果显示5Fu关节腔内注射可明显抑制滑膜炎症，使滑膜细胞的数量明显下降，滑膜细胞从功能旺盛状态恢复至正常，关节液中有害细胞因子数量减少，软骨中有害细胞因子的表达下降，明显改善软骨的破坏。在与目前常用的关节腔内治疗药物透明质酸钠和激素治疗效果的对比研究中发现，5Fu的治疗效果要明显好于这两种药物。本实验研究结果为下一步进行临床试验提供了基础和依据。不过我们仍要谨慎的指出，本研究只是5Fu关节腔内注射治疗骨性关节炎的初步动物实验结果，其生物有效利用度和长期疗效还需要进一步的研究，其缓释制剂和靶向释放技术也值得进一步深入研究。