Akt/eNOS信号通路在EPO促进慢性缺氧心肌细胞线粒体生物合成中作用的实验研究

背景：紫绀型先天性心脏病仍旧严重威胁着人类的生命健康。慢性缺氧是这类病人的共同病理生理过程，但心肌细胞的慢性缺氧机制尚不完全清楚。 在缺氧时EPO受HIF-1α的调节分泌增加，以往认为EPO水平升高，主要是通过其造血作用进而增加循环血液中成熟红细胞数量和血红蛋白含量，提高血液携氧能力应对缺氧。但近期发现，EPOR能够表达于包括心肌在内的多种非造血组织，EPO可以通过作用于心肌EPOR产生不依赖造血的直接效应，显著减轻有害应激如缺血、缺氧所导致的心肌损伤，但其机制尚不清楚。Akt是EPO/EPOR信号通路下游重要的信号分子之一，而eNOS(endothelial nitric oxide synthase，内皮型一氧化氮合酶)作为Akt的下游信号，可以调节NO(nitric oxide，一氧化氮)的合成进而调节线粒体生物合成。我们的前期研究发现紫绀型先心病患者心肌EPOR蛋白较非紫绀型先心病患者表达增加，提示慢性缺氧心肌EPO/EPOR信号增强。因此，我们推测：慢性缺氧条件下，EPO与EPOR结合后，可能通过激活其下游Akt/eNOS通路参与了线粒体生物合成作用，从而参与了心肌慢性缺氧适应。 目的： 观察EPO在慢性缺氧条件下对心肌线粒体生物合成的影响及其可能的机制。 方法： 1．观察EPO对慢性缺氧心肌细胞线粒体生物合成的影响将H9c2细胞株置入缺氧培养箱(94%N2，5%CO2，1%O2)，培养1周后建立慢性缺氧模型；采用不同浓度的rhEPO(recombinant human erythropoietin；重组人促红细胞生成素)对缺氧培养H9c2细胞株进行干预处理，未经rhEPO处理的慢性缺氧细胞组为空白对照；用荧光探针标记线粒体，观察线粒体数目的变化；RT-PCR技术检测线粒体DNA的相对拷贝数变化；Western blot技术检测Akt、eNOS及其磷酸化蛋白水平的变化。 2．观察Akt/eNOS信号通路的介导作用Wortmannin为Akt磷酸化的特异性阻断剂；向慢性缺氧培养的心肌细胞细胞株内分别加入20U/mL rhEPO，20U/mLrhEPO+Wortmannin100nmol/mL，检测Akt、P-Akt、eNOS、P-eNOS蛋白水平的变化及线粒体拷贝数的变化；构建shRNA质粒，将带有荧光蛋白标记的质粒转染至慢性缺氧心肌细胞株；一组质粒中带有eNOS基因干扰片段，另一组空载体质粒设为阴性对照；将两组细胞株经rhEPO20U/mL处理后，检测eNOS、P-eNOS蛋白表达水平并观察线粒体拷贝数的变化。 结果： 1．rhEPO干预后慢性缺氧心肌细胞株线粒体数目及拷贝数增加(P<0.05)，Akt、eNOS蛋白磷酸化水平增强(P<0.05)，Akt、eNOS总蛋白无明显变化(P>0.05)； 2．特异性阻断Akt磷酸化后，Akt、eNOS磷酸化水平较未阻断组均减弱(P<0.05)，总蛋白浓度无差异(P>0.05)；线粒体拷贝数较未阻断组亦减少(P<0.05)；shRNA干扰eNOS表达后，eNOS及P-eNOS的蛋白表达水平减弱(P<0.05)，线粒体的拷贝数亦减少(P<0.05)。 结论： 慢性缺氧条件下，EPO介导Akt/eNOS信号通路参与了心肌细胞线粒体生物合成作用。