人参皂苷Rg1防治兔膝关节骨性关节炎的实验研究

目的本实验以“补元”思想理论为指导,从“治未病”理念出发,分别从细胞因子含量变化、关节形态学改变、软骨细胞增殖与凋亡四个方面、不同角度与层次研究补元要药人参的有效成分人参皂苷Rg1对兔膝关节骨性关节炎的防治作用,为中医药防治骨性关节炎提供科学的实验研究依据。方法50只健康普通级新西兰雄性大白兔,分成正常组、模型组、人参皂苷Rg1低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余4组兔采用左后肢管型石膏伸直位固定法制备兔膝骨性关节炎模型。从造模第2天开始进行药物干预。人参皂苷Rg1低、中、高剂量组分别给予人参皂苷Rg15mg/kg、10mg/kg、20mg/kg灌胃给药,正常组及模型组予以等剂量生理盐水(5mL/kg)灌胃,每周3次,共6周。1.炎性细胞因子检测:各组分别于造模前及干预结束后,在严格无菌操作条件下行左膝关节穿刺,注入生理盐水1ml、反复抽吸多次使冲洗液混匀后抽取关节液,测定干预前后关节液中重要致炎因子白细胞介素1(IL-1)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量变化。2.细胞形态学观察:干预结束后在麻醉下用空气栓塞法处死所有实验兔,分别从大体肉眼观、光镜及透射电镜(TEM)等方面,观察各组兔膝关节组织形态学改变及超微结构变化,并对观察结果进行Mankin评分。3.软骨细胞增殖实验:取负重面关节软骨,采用RT-PCR技术检测软骨细胞增殖周期关键调控因子Cyclin D1、P21 mRNA表达情况;Western-blot技术检测Cyclin D1、P21蛋白表达情况;增殖细胞核抗原(PCNA)检测及细胞增殖指数(PI)分析软骨细胞增殖活性,以研究人参皂苷Rg1对软骨细胞增殖的影响。4.软骨细胞凋亡实验:取负重面关节软骨,采用RT-PCR技术检测细胞凋亡关键调控因子caspase-3、bax/bcl-2mrna表达情况;western-blot技术检测caspase-3、bax/bcl-2蛋白表达情况,原位末端标记法(tunel)观察软骨细胞凋亡率,以研究人参皂苷rg1对软骨细胞凋亡的影响。结果1.炎性细胞因子含量变化:干预前各组关节液内no、il-1、tnf-α含量无明显差异(p>0.05),干预结束后模型组关节液内no、il-1、tnf-α含量较干预前显著提高(p<0.01);人参皂苷rg1低、中、高剂量组no、il-1、tnf-α含量明显低于模型组,差异有明显统计学意义(p<0.01),且人参皂苷rg1中、高剂量组no、il-1、tnf-α含量低于人参皂苷rg1低剂量组(p<0.05或p<0.01)。人参皂苷rg1中、高剂量组相比,no、il-1、tnf-α含量差别无明显统计学意义(p>0.05)。2.组织形态学变化:大体肉眼观:正常组关节软骨表面整齐光滑有弹性,无软化及缺损;模型组关节软骨呈灰黄色,磨损严重,弹性差,局部出现溃疡,滑膜大量增生;人参皂苷rg1低剂量组关节软骨呈黄色,关节表面略显粗糙,无软骨缺损,滑膜少量增生;人参皂苷rg1中、高剂量组关节软骨表面尚光滑,无软骨缺损。光镜观察:正常组关节软骨表面光滑,四层结构清晰有序,潮线完整;模型组关节软骨层变薄,软骨细胞数量减少,形态发生改变,排列混乱,裂隙深达辐射层,潮线破坏,番红o染色重度减弱;人参皂苷rg1低剂量组关节软骨层次基本完整,局部有表浅裂隙,潮线尚完整,番红o染色轻、中度减弱;人参皂苷rg1中、高剂量组关节软骨层次完整,软骨表面尚光滑,排列轻度紊乱,潮线完整,番红o染色轻度减弱。mankin评分:模型组评分最高,其余各组与模型组比较,差异有显著性意义(p<0.01),人参皂苷rg1中、高剂量组mankin评分低于人参皂苷rg1低剂量组,差异有统计学意义(p<0.01),但中、高剂量组两组间比较差别无统计学意义(p>0.05)。电镜观察:模型组软骨细胞轮廓不清,外形不规则,细胞器肿胀甚至消失,核固缩,染色质边聚,甚至出现核分裂,凋亡小体形成;人参皂苷rg1低剂量组软骨细胞轻度萎缩,轮廓尚清晰,胞浆内细胞器轻度肿胀,胞核完整,核膜稍内陷,染色质分布轻度边聚;人参皂苷Rg1中、高剂量组软骨细胞超微结构接近于正常组。3.软骨细胞增殖实验:人参皂苷Rg1低、中、高剂量组P21 mRNA及相应蛋白的表达均低于模型组(P<0.05或P<0.01),而CyclinD1 mRNA及相应蛋白的表达高于模型组(P<0.05或P<0.01),PCNA检测显示人参皂苷Rg1低、中、高剂量组软骨细胞增殖率明显高于模型组(P<0.01)。各项指标中以中剂量组效果最佳。4.软骨细胞凋亡实验:模型组Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达明显高于正常组(P<0.01)及人参皂苷Rg1低、中、高剂量组(P<0.05或P<0.01);模型组Bcl-2 mRNA及蛋白表达明显低于正常组(P<0.01)及人参皂苷Rg1低、中、高剂量组(P<0.05或P<0.01)。Tunel法检测显示,低、中、高剂量组凋亡率显著低于模型组(P<0.01);中、高剂量组凋亡率无显著差别(P>0.05),但低于低剂量组(P<0.05或P<0.01)。各项指标中以中剂量组效果最佳。结论1.伸直位管型石膏固定法造模6周,可成功建立类似临床所见的人类骨关节炎模型。2.一定剂量人参皂苷Rg1可有效减少关节液中炎性细胞因子NO、IL-1、TNF-α的含量,减轻关节炎症反应,改善关节内微环境。3.一定剂量人参皂苷Rg1可有效提高软骨细胞G1期关键正向调节蛋白CyclinDl的表达,抑制负向调控因子P21表达,推动软骨细胞顺利通过G1/S限制点,进入S期完成增殖周期,从而有效促进软骨细胞增殖和关节软骨的修复。4.一定剂量人参皂苷Rg1可通过调控软骨细胞凋亡关键因子Bax/Bcl-2表达比例、下调Caspase-3的表达来有效抑制软骨细胞过度凋亡,避免软骨组织进行性破坏。