基于miRNA-21/TLR4/MAPK/NF-κB信号通路探讨新风胶囊改善RA心功能的机制研究

研究目的以miRNA-21/TLR4/MAPK/NF-κIB信号通路为研究靶点,探讨益气健脾化湿通络中药新风胶囊调控miRNA-21/TLR4/MAPK/NF-κB信号通路改善RA心功能的机制。研究方法1.在体实验雄性Wistar大鼠,除正常组(NC)外,向每只大鼠右足跖皮内注射弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant,FCA)0.1 ml 致炎,复制佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)大鼠模型。致炎后第19天,将AA大鼠模型随机分为5组:模型组(Model)、新风胶囊组(Xinfeng capsule,XFC)、雷公藤甲素组(triptolide,TPL)、黄苗糖蛋白组(HuangQi Glycoprotein,HQGP)、甲氨喋吟(methopterin,MTX)组。连续给药 30 天。给药结束后,处死动物收集组织器官,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察心肌变化,超微电镜观察心肌细胞超微结构,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-17水平,定量PCR检测心脏组织中miRNA-21的水平,Western blotting(WB)检测 TLR4、p-p38、p-p65 蛋白水平。2.离体实验将XFC混悬液按1ml/100g的剂量进行大鼠灌胃给药,每日1次,连续3日。对照组灌胃等量生理盐水。末次给药1 h后,麻醉大鼠,腹主动脉采集全血,分离血清备用。采用LPS处理的H9C2心肌细胞作为RA心功能细胞水平改变的模型,分为空白对照组(溶媒处理)、TPL组(TPL处理)、LPS刺激组(LPS处理)、XFC含药血清干预组(XFC+LPS处理)、miRNA-21特异性抑制剂干预组(XFC+miRNA-21+LPS处理)。各组干预后,qPCR检测各组细胞中miRNA-21的水平,MTT法检测心肌细胞增殖活性,WB、免疫荧光测定心肌细胞中TLR4、p-p38、p-p65蛋白表达,ELISA检测细胞培养上清中TNFα、IL-6、IL-17等炎性因子表达,流式检测对细胞凋亡的影响。研究结果1.在体实验与对照组相比,模型组大鼠无论HE染色还是电镜观察心肌细胞超微结构显示心肌损害明显,心肌细胞TUNEL染色阳性细胞较正常对照组大鼠明显增加。与正常组相比,模型组大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-17、心肌中miRNA-21及TLR4高表达,MAPKp38通路和NF-κB-p65的磷酸化水平显着升高。采用XFC、黄芪多糖及TPL处理的大鼠其心肌细胞阳性染色数明显少于模型组大鼠。XFC及其各组分处理组血清炎症因子、miRNA-21及TLR4的表达水平降低,TLR4下游MAPKp38、NF-κB p65通路蛋白的活化水平降低。XFC组与其各组分组相比,XFC组的相关指标降低的程度更大。2.离体实验低浓度的雷公藤甲素(TPL,1,10 ng/ml)对大鼠H9C2的生长无明显影响;而高浓度的TPL(20 ng/ml)能够显着降低大鼠H9C2心肌细胞活力。雷公藤甲素在不影响心肌细胞活力与凋亡率的条件下抑制miR-21的表达,抑制TLR4、p-p38、p-p65的表达,降低TNF-α、IL-6和IL-17的表达水平。新风胶囊含药血清显着抑制LPS诱导的miRNA-21表达(P<0.01),新风胶囊含药血清和miRNA-21 inhibitor联合处理组miRNA-21水平也较LPS组显着降低。Western blotting检测显示:新风胶囊含药血清抑制LPS诱导的TLR4、p-p38、p-p65表达水平,miRNA-21 inhibitor逆转这种抑制作用。免疫荧光检测心肌细胞中TLR4、p-p38、p-p65蛋白表达所得结果与Western blotting结果一致。新风胶囊含药血清处理抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-17的表达水平。与新风胶囊含药血清组相比,新风胶囊含药血清联合miRNA-21 inhibitor组TNF-α、IL-6和IL-17的水平进一步升高。新风胶囊含药血清处理抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡。与新风胶囊含药血清组相比,新风胶囊含药血清联合miRNA-21inhibitor共同处理组心肌细胞凋亡率升高。研究结论1.新风胶囊、黄芪多糖及雷公藤甲素可改善RA足趾肿胀度与关节炎指数、心脏病理形态结构、心肌细胞超微结构的变化。2.新风胶囊、黄芪多糖及雷公藤甲素可抑制RA心肌细胞凋亡。3.新风胶囊、黄芪多糖及雷公藤甲素可抑制RA血清炎性因子的水平,其中新风胶囊的抑制作用优于黄芪多糖、雷公藤甲素及甲氨喋呤组。4.RA心脏组织中miRNA-21高表达,新风胶囊、黄芪多糖及雷公藤甲素可抑制RA心脏组织中miRNA-21的高表达,其中新风胶囊的抑制作用优于黄芪多糖、雷公藤甲素及甲氨喋呤组。RA心脏组织中TLR4/MAPKp38/NF-κB通路被激活,新风胶囊、黄芪多糖及雷公藤甲素可抑制RA心脏组织中TLR4/MAPKp38/NF-κB通路的激活,其中新风胶囊的抑制作用优于黄芪多糖、雷公藤甲素及甲氨喋呤组。5.新风胶囊含药血清可能通过抑制miR-21和TLR4/MAPK/p38-NF-κB通路来抑制LPS对心肌细胞的炎症与凋亡、保护心肌细胞活力。因此,新风胶囊可能通过抑制miR-21和TLR4/MAPK/p38-NF-κB通路来抑制RA心肌炎症、凋亡,保护心肌活力。