基于代谢组学技术的新疆哈萨克族食管鳞癌血浆特征代谢物及临床意义研究

目的：新疆是我国食管癌高发区之一，尤其是北部哈萨克族食管癌的发病率最高。目前研究认为肿瘤细胞代谢异常与肿瘤增殖密切相关。寻找食管癌发生、发展过程中的相关代谢产物有助于研究食管癌发生、发展的机制，从而为食管癌的预防、诊断及治疗提供理论基础。代谢组学是继基因组学、蛋白质组学等之后的一个新兴学科，在发现肿瘤分子标志物、研究肿瘤代谢特征和靶标治疗方面具有独特的优势。目前食管癌的分子病理学研究大多着眼于基因和蛋白水平，而关于其代谢组学的研究仍然较少。本研究采用核磁共振（1H-NMR）作为代谢组学研究的检测手段，以新疆哈萨克族食管癌患者和健康者的血浆为研究对象，分析食管癌患者血浆的特征代谢谱；进一步采用代谢靶标技术高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）法分别定量检测血浆中19种氨基酸、10种脂肪酸类代谢物的含量。结合模式识别技术对食管癌相关的代谢物进行全面系统的研究，并探讨差异性代谢物与食管癌临床病理特征的关系，从整体代谢水平上为食管癌辅助诊断、临床治疗和发病机制的研究提供实验基础和新的视角。方法：1)收集新疆医科大学第一附属医院胸外科确诊的108例哈萨克族食管鳞癌患者和40例体检健康志愿者血浆。利用1H-NMR技术结合正交偏最小二乘判别分析法（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），分析检测新疆哈萨克族食管癌患者、健康者血浆代谢组分，确定食管癌患者的差异性代谢组分。2）建立HPLC法分析血浆样品中游离氨基酸的代谢靶标分析技术平台，应用该技术对51例哈萨克族食管癌患者和60例健康者血浆中氨基酸代谢谱进行研究；采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模式识别法对食管癌患者和健康者的氨基酸代谢谱进行分类。进一步结合两组独立样本T检验筛选潜在的氨基酸标志物并分析与临床病理特征的关系。3）建立GC法检测血浆中游离脂肪酸的技术平台，优化GC的最优条件。应用此方法分析51例哈萨克族食管癌患者和60例健康者血浆的10种游离脂肪酸，采用PLS-DA模式识别法分析两组间脂肪酸代谢谱的差异；结合两组独立样本T检验筛选潜在的脂肪酸标志物并探讨与临床病理特征的关系。结果：1）建立了基于1H-NMR的血浆代谢组学方法，食管癌患者和健康者经代谢组学方法得到很好的区分，并找到了多个相对应的食管癌特征代谢物。食管癌组的大部分血浆代谢物浓度较健康者低。结合两组血浆样品的1H-NMR谱图的不同轮廓，与健康者相比，食管癌患者血浆中多种氨基酸含量显著下降，包括亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，糖蛋白、乳酸、丙酮、乙酸、胆碱、肌酸酐、异丁酸和1-甲基组氨酸及脂肪分解产物不饱和脂类、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量也显著下降，与健康者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。同时，食管癌患者血浆中二甲胺、α-葡萄糖和β-葡萄糖、柠檬酸含量明显增加，与健康者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步利用OPLS-DA法对不同临床病理特征食管癌患者血浆特征代谢物进行分类，发现差异性代谢物与淋巴结转移、浸润深度和细胞分化程度有关。2）应用反相色谱柱和梯度洗脱对血浆样品进行氨基酸HPLC分离。通过色谱条件的优化及方法学考察，选择的6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）为衍生剂的方法重复性、稳定性好。采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对HPLC得到的氨基酸数据进行分析发现，HPLC分析得到的血浆氨基酸代谢谱能显著区分食管癌患者和健康者的代谢表型差异，有效的区分食管癌患者和健康者的氨基酸代谢轮廓。结果显示，与健康者相比除胱氨酸外，食管癌患者血浆所有氨基酸含量呈现下降趋势。通过两组独立样本T检验发现，与健康者相比，食管癌患者血浆中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、牛磺酸、丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量明显下降，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；而胱氨酸含量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与高分化组相比，中低分化组天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、牛磺酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸含量显著降低，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。与淋巴结转移阴性组比较，阳性组天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量明显下降，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。与未侵及肌层组相比，侵及肌层组谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、牛磺酸、丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量明显下降，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究提示HPLC靶标分析技术可作为高效和简单的技术平台用于食管癌的代谢轮廓研究，具有作为早期诊断和预后判断的潜力。3）建立硫酸/甲醇为甲酯化试剂测定血浆中游离脂肪酸的GC分析方法，优化GC色谱的最优条件。结合PLS-DA对血浆脂肪酸代谢谱进行模式识别发现食管癌组和健康组有效区分。通过两组独立样本T检验发现，与健康者相比，食管癌组血浆中亚油酸、二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）含量显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；而花生四烯酸含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与高分化组相比，中低分化组血浆棕油酸、亚油酸、EPA含量显著降低，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）；而花生四烯酸、硬脂酸含量显著上升，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。与淋巴结转移阴性组比较，阳性组血浆脂肪酸亚油酸、油酸、EPA和DHA含量明显下降，而硬脂酸含量升高，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。与未侵及肌层组相比，侵及肌层组血浆亚油酸含量明显下降，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结果提示脂肪酸可能成为潜在的特异性标志物，为食管癌患者体内脂肪酸失衡的研究提供了重要的实验依据。结论：1）基于1H-NMR技术可以较好地区分食管癌患者及健康者的血浆样本，获得食管癌特征代谢标志物，并发现它们与能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等密切相关。基于1H-NMR技术是寻找小分子特征标志物的有效方法，对食管癌的早期甚至不同病理分期的诊断、药物治疗及发生机制的理解寻找到了新的切入点。2）食管癌患者血浆中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、牛磺酸、丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量下降，并且与临床病理特征相关，可作为食管癌患者的潜在氨基酸标记物。食管癌血浆氨基酸代谢谱对于早期诊断和筛查具有很大的潜力，并有助于对肿瘤发生机制的理解及为不平衡氨基酸治疗提供理论依据。3）食管癌患者血浆中存在脂肪酸代谢紊乱，其中多不饱和脂肪酸DHA、EPA、亚油酸和花生四烯酸在两组中有显著差异，并与淋巴结转移、浸润深度和细胞分化程度有关。DHA、EPA、亚油酸和花生四烯酸可作为食管癌患者的潜在肿瘤标记物，对食管癌的早期诊断和预后判断提供帮助。