雷公藤红素对破骨细胞分化和胶原诱导关节炎鼠模型骨侵蚀的影响

实验目的： 探讨雷公藤红素对破骨细胞分化和胶原诱导关节炎鼠模型骨侵蚀的影响。 实验方法： 1.细胞模型： 通过诱导RAW264.7向破骨细胞分化,观察雷公藤红素对破骨细胞分化成熟的影响及分子机制。内容主要包括：1.通过CCK-8及Annexin V-FITC/PI双染法确定雷公藤红素作用于诱导RAW264.7向破骨细胞分化过程的安全浓度；2.通过TRAP染色及骨吸收陷窝实验观察雷公藤红素对破骨细胞分化成熟及骨吸收功能的影响；3.通过检测破骨细胞分化标志性基因(Trap、Ctsk、CTR、MMP-9),分化相关转录因子(c-Fos、c-Jun、NFATc1)的表达及破骨细胞分化下游NF-κBp65、MAPK (ERK、JNk和p38)信号通路的磷酸化水平,探讨雷公藤红素影响破骨细胞分化成熟及骨吸收功能的分子机制。 2.动物模型： 胶原诱导关节小鼠关节炎(CIA)模型,探讨雷公藤红素对CIA模型鼠骨侵蚀的影响及机制。内容主要包括：1.通过小鼠关节炎评分及关节病理切片HE染色观察雷公藤红素对胶原诱导关节炎小鼠关节炎症的作用；2.通过小鼠关节Micro-CT三维重建及血清中及关节中TRAP的表达,直观观察雷公藤红素对胶原诱导关节小鼠关节破坏及体内破骨细胞分化及功能的影响；3.通过检测破骨细胞标志性基因(Trap、Ctsk、CTR、MMP-9),分化相关转录因子(c-Fos、c-Jun、NFATc1)的表达探讨雷公藤红素对胶原诱导关节炎小鼠破骨细胞分化成熟及骨吸收功能的分子机制。 实验结果： 1.细胞模型 CCK-8及Annexin V-FITC/PI双染实验结果表明,雷公藤红素用量小于0.3μM时在RAW264.7向破骨细胞分化过程中是安全的,对细胞无明显毒性及促凋亡作用。TRAP染色实验结果表明,与诱导对照组相比,雷公藤红素可以呈剂量依赖性显著抑制破骨细胞的产生,当雷公藤红素作用浓度为0.3μ M时,几乎可以完全抑制破骨细胞的生成。(P<0.01)。骨吸收陷窝实验结果表明,与诱导对照组相比,雷公藤红素可以呈剂量依赖性显著抑制破骨细胞骨吸收陷窝的产生,当雷公藤红素作用浓度为0.3μ M时,几乎可以完全抑制破骨细胞的骨吸收功能(P<0.01)。Real-time PCR实验结果表明,与诱导对照组相比,雷公藤红素可以显著抑制破骨细胞标志性基因Trap、Ctsk、CTR、MMP-9mRNA(P<0.01)。Real-timePCR及Western blot实验结果表明,与诱导对照组相比,雷公藤红素可以显著抑制破骨细胞分化相关转录因子NFATc1、c-Fos、c-Jun的表达(P＜0.01)。 Western blot实验结果表明,与诱导对照组相比,在20min、40min及60min时,雷公藤红素明显抑制NF-κB p65、 MAPK(JNK、ERK, p38)磷酸化水平。 2.动物模型 关节炎评分结果表明,与胶原诱导关节炎组相比,雷公藤红素治疗组可以显著抑制胶原诱导关节炎小鼠关节炎症(P<0.01)。HE染色及关节组织病理学评分结果表明,与胶原诱导关节组相比,雷公藤红素组关节组织病理学评分显著降低(P<0.01)。Micro-CT及关节TRAP染色结果显示,与胶原诱导关节组相比,雷公藤红素可以有效阻止胶原诱导关节炎小鼠骨侵蚀水平。ELISA法检测血清中TRAP的表达结果表明,与胶原诱导关节组相比,雷公藤红素可以显著下调小鼠血清中TRAP含量(P<0.01)。 Real-time PCR实验结果表明,与胶原诱导关节炎组相比,雷公藤红素可以明显抑制Гrap、NFATc1mRNA的表达(P<0.05),显著抑制Ctsk、c-Fos、c-Jun mRNA的表达(P<0.01)。 结论： 1.雷公藤红素通过抑制RANKL下游NF-κB p65、MAPK(ERK、JNK、p38)信号通路磷酸化水平及转录因子c-Fos、c-Jun、NFATcl的表达,显著抑制RANKL诱导的RAW264.7破骨细胞分化及骨吸收功能。 2.雷公藤红素可以通过直接抑制RANKL信号通路下游转录因子c-Fos、c-Jun、NFATc1表达来抑制破骨细胞分化激活,从而减轻胶原诱导关节炎小鼠关节炎鼠骨侵蚀。 3.除抗炎作用外,雷公藤红素能直接抑制破骨细胞分化激活。