中药水蛭（H.nipponia Whitman）抗凝血活性部位的临床前研究

20世纪80年代初，通过病理、血管造影和血管显微等技术手段，显示不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞（胸痹心痛症）都是由于冠状动脉粥样硬化斑块破裂，使凝血激活，导致血栓形成。在此新的认识基础上，抗凝血药开始在心肌缺血疾病中广泛使用，抗凝血药也成为新药开发的一个热点。 水蛭作为一味传统中药，具有活血化瘀之功效。近年来，随着对活血化瘀治疗各种疑难病的不断深入研究，水蛭的药用也倍受青睐，单味水蛭或其配伍复方在中医临床上，用其煎剂、胶囊剂、片剂和口服液等剂型，通过内服、外用等途径给药，广泛治疗不同系统的血瘀症，特别是心、脑血管疾病，疗效确切。但对作用迅速、生物利用度高，可用于急性胸痹心痛症（急性冠状动脉缺血综合症）这一急重症的注射剂型研究较少。 自19世纪末以来，对水蛭唾液中活性成分开展了一系列研究，发现吸血水蛭唾液中存在一种作用于凝血酶的独特抗凝物质，随后其抗凝作用得到普遍认可。药理研究结果亦表明：水蛭主要通过抗凝作用，促进血液循环、改善血液流变，抑制凝血酶催化的凝血反应以及凝血酶介导的炎症细胞浸润、平滑肌细胞迁移和成纤维细胞增殖等反应，发挥其活血化瘀的功效。 本实验对传统活血化瘀中药水蛭的抗凝血活性部位进行提取、分离和纯化。确定此活性部位的制剂形式和给药途经，并结合中药注射剂的安全性要求，初步建立制备工艺路线、药材和制剂的质量控制方法。在此基础上，对制剂的安全性、抗凝血和抗血栓药理效应进行初步研究。 初步建立了在室温下，分别用2、1、1倍于药材重量的磷酸盐缓冲液（0.2M，PH 7.0）对药材重复提取3次，60%乙醇沉淀去除杂蛋白，40℃减压浓缩，80%乙醇结合PH调节沉淀活性部位的工艺路线。确定了以磷酸盐（0.2M，PH7.0）为PH调节剂、甘露醇（20mg/ml）为填充剂的制剂处方和过滤除菌、冰冻干燥的制剂成型工艺。 对药材的抗凝血酶效价进行了测定，暂定每克药材的抗凝效价不低于70个抗凝血酶单位。建立了干扰小、稳定性和线性良好、精密度、重复性和回收率高的制剂含量和抗凝活性测定方法。 制剂以120AT-u/Kg的剂量给小鼠尾静脉注射时，即可使小鼠全血凝血时间、血浆复钙时间、血浆凝血酶原时间、白陶土部分凝血活酶时间较对照显著延长，凝血时间的延长与剂量呈相关性。通过血浆凝血酶原时间延长的纠正实验以及体外凝血酶时间测定，揭示制剂主要通过抑制凝血酶活性，延长血液凝固时间，阻止血液凝固。制剂以600AT-u/Kg的剂量给小鼠灌胃，未观察到小鼠凝血时间的延长。制剂以120AT-u/Kg的剂量，术前10分钟大鼠尾静脉给药，可降低大鼠下腔静脉血栓的形成率；在480AT-u/Kg的剂量下，可完全预防大鼠下腔静脉血栓的形成。制剂静脉注射后，迅速产生的抗凝血药理效应，可持续30分钟左右，随时间的延长，抗凝药理效应逐渐下降，2小时后与对照无显著差异。制剂无过敏、溶血和血管刺激性反应现象。