金雀异黄素对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞OPG/RANKL/RANK通路的影响

目的：研究金雀异黄素(genistein, Gen)对CIA大鼠及人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS) OPG/RANKL/RANK通路的影响及机制研究。 研究对象： CIA大鼠、人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞 方法： 将60只SD大鼠随机分为六组,每组10只,分别为空白对照组、造模组、低剂量金雀异黄素组、中剂量Gen组、高剂量Gen组和甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)阳性对照组。造模组和各治疗组均采用完全弗氏佐剂和Ⅱ型胶原皮下注射建立CIA模型,于造模次日开始用药, Gen组每天胃内灌注Gen混悬液lml,低、中、高剂量Gen治疗组的Gen浓度分别为50gM、100μM和200μM；MTX阳性对照组也于造模后开始用药,每周胃内灌注MTX悬液1ml,浓度为0.1mg/ml;而空白组和模型对照组每天灌注等量的生理盐水。所有实验组大鼠每周进行一次关节炎指数(arthritis index, AI)评分及后肢容积测定。第五周对大鼠进行腹主静脉采血,采取3m1置于血清管中分离出血清后,用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测各组大鼠血清中核因子一K B受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factors-κB ligand, RANKL)及骨保护素(osteoprotegerin, OPG)的水平。 培养人类风湿关节炎FLS, FLS培养至3代后进行试验。试验共分为四组：空白对照组、TNF α组、TNF α+Gen组及Gen组,免疫印迹(Western Blot)检测Gen作用人FLS细胞RANK、RANKL、OPG、雌激素受体(estrogen receptor a, ERα)表达情况,免疫荧光检测ER α细胞内分布情况。 结果： 1、骨代谢因子RANKL在模型组大鼠血清中表达量的显著高于空白对照组(p<0.05)；Gen能下调RANKL的分泌,中、高剂量Gen对RNAKL的抑制作用与MTX相当。模型组大鼠血清中的细胞因子OPG的表达水平低于空白对照组(p<0.05)；Gen能上调OPG的分泌。中、高剂量Gen对OPG的上调作用与MTX相当。 2、Western Blotting结果显示：Gen可以上调人RA-FLS中OPG、RANKL,对OPG上调作用更强,Gen组OPG/RANKL增高；但Gen对RANK表达无明显影响。 3、Western Blotting结果显示：Gen对ER α表达无明显影响；此外,免疫荧光结果显示：与对照组比较,Gen组ERα核内明显增高。 结论： 1、体内试验结果提示,Gen能够影响CIA大鼠血清中RANKL、OPG水平,同时对OPG/RANKL比值有影响,提示Gen可能通过RANKL/OPG/RNAK通路抑制RA骨质破坏。 2、Gen上调人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RANKL、OPG,但对OPG上调作用更强,提示Gen可能通过影响OPG/RANKL平衡,发挥其抑制RA骨质破坏作用。 3、Gen对RA-FLS的ER a表达量无明显影响,但能影响ER α入核,提示其可能其通过与雌激素受体结合,转入核内发挥作用,从而调节OPG/RANKL/RANK通路,进而发挥抑制骨破坏的作用。