怀牛膝的抗炎活性评价和毒理学检验

牛膝(Achyranthes bidentata Blume.)为石竹目苋科牛膝属多年生草本植物,是我国常用的大宗中药材之一。中医学上牛膝归肝、肾经,具有补肝肾,强筋骨,活血通经,引火下行,利尿通淋等功效。多用于月经不调、痛经、闭经、产后淤阻腹痛、跌打损伤及腰膝酸痛、下肢无力、尿血、小便不利、尿道涩痛等症,为临床常用中药。现代药理学研究表明牛膝还具有抗衰老、抗肿瘤、镇痛消炎、提高机体免疫力等多种功效。 牛膝入药往往只使用其干燥的根,大量的药理、临床研究都集中在其根部,地上部分如种子、叶子等的研究并不是很多,且多数都只停留在对其营养成分的分析方面。在扬州民间,常常用牛膝地上部分泡茶饮,用以缓解咽部不适,效果较佳。考察古籍与现代临床资料我们也找到了类似的医案,只是相关可供参考的科学理论依据并不是很多。 本课题以怀牛膝(牛膝在传统中药药材质量中,以河南怀庆府所产的“怀牛膝”质量最好)地上部分为主要原料,对其清咽功能进行研究,具体研究内容包括： 1怀牛膝地上部分抗炎活性的检测 参考《保健食品检验与评价技术规范》(2003)中“清咽功能”的评价方法,选择大鼠足趾肿胀试验来检验怀牛膝粗提物和正丁醇有机相的抗炎活性。结果表明,正丁醇萃取部位的抗炎活性能力最强,经统计学分析与空白组比较显著性差异明显。其有效剂量为750m/kg。 2抗炎活性部位的定性、定量及抗炎活性能力研究 采用显色反应如Libermann反应、Molish反应等和泡沫反应试验对抗炎活性部位进行定性研究,结果表明抗炎活性物质为酸性皂苷类化合物。 抗炎活性物质的定量研究,以齐墩果酸为对照品,利用HPLC法对活性物质进行分析,最终确立分析的色谱条件为：色谱柱Zorbax300SB-C18(4.6mm×150mm,5um),最佳流动相为甲醇：水=88：12,流速：1.Oml/min,柱温：35℃,进样量：10μl。经计算,样品中齐墩果酸的含量为1.2%。从而确定怀牛膝地上部分原料中具有清咽功能的主要活性物质为五环三萜皂苷,皂苷元为齐墩果酸。 以大鼠足趾肿胀实验对怀牛膝皂苷的抗炎活性规律进行研究,共设5个组别,分别为空白对照组、阳性对照组和3个受试样品剂量组。各组分别按1ml/100g灌胃量给药。第一组为空白对照组灌胃给予10ml/kg蒸馏水,第二组为阳性对照组灌胃给予50mg/kg (?)可司匹林,第三组为怀牛膝总皂苷小剂量组,灌胃给予400mg/kg的受试物,第四组为怀牛膝总皂苷中剂量组,灌胃给予800mg/kg的受试物,第五组为怀牛膝总皂苷高剂量组,灌胃给予1200mg/kg的受试物。每日清晨空腹灌胃,晚间禁食12h,不控制饮水,连续给药30天。结果表明,中剂量组800mg/kg(?)口高剂量组1200mg/kg灌胃给药30天后给予致炎剂,分别在1小时、3小时、5小时、7小时时足趾厚度的差值与对空白照组相比差异显著,经SPSS统计软件分析,p<0.01或p<0.05,表明该浓度的受试样品对试验动物具有清咽功能,且抗炎功效可维持7小时之久。小剂量组即每公斤体重给药400mg组没有表现出抗炎消肿的功能,SPSS统计分析的p>0.05。 3毒理学检验 从急性毒理和30喂养试验两方面对牛膝总皂苷进行毒理学检验。 急性毒性试验,选用清洁级Wistar大鼠12只,雌雄性别各半,适应喂养7天后用于实验。按外来化学物急性毒性分级中微毒(5000mg/kg)剂量灌胃给予大白鼠。连续观察14天,观察实验大白鼠的各种性状,并记录中毒症状和死亡情况。通过14的天喂养实验后观察,12只大鼠(雌雄各半)饮食、活动粪便情况正常,生长发育良好,无一只出现明显中毒症状,也无一只死亡,基本证明怀牛膝抗炎活性部位安全性很高。 通过30天的喂养实验后观察,大鼠饮食、活动粪便情况正常,生长发育良好,无一只死亡。大鼠的肝、血液循环系统、肠胃系统、泌尿系统、造血或凝血系统、神经系统、眼、呼吸系统、内分泌系统、生殖系统、骨骼系统、心血管系统、皮肤和肌肉的一般检查均无异常反应出现,基本证明怀牛膝总皂苷无毒。