目的本研究以慢性孕前应激诱导构建产后抑郁(postpartum disease, PPD)小鼠模型,评估母鼠的产后抑郁样行为。检测精神分裂症断裂基因1(Disrupted in schizophrenia 1,DISC1)在产后抑郁母鼠海马脑区的基因表达变化,探讨孕前应激对母鼠海马脑区DISC1-Akt-mTOR信号通路蛋白表达的影响,以及对于海马齿状回神经发生、神经内分泌的影响,揭示孕前应激诱导产后抑郁样行为的分子机制。观察中药越鞠甘麦大枣汤(越甘)单次给药对产后抑郁母鼠的快速抗抑郁作用,通过检测越甘对PPD母鼠海马DISC1-Akt-mTOR信号通路蛋白表达的影响,从DISCI信号通路探讨中药越甘发挥快速治疗产后抑郁症的分子机制,从而为产后抑郁的预防治疗及新药研发提供科学的理论依据和实验依据。方法1.将Balb/c小鼠随机分为2组,空白对照组不给予任何刺激,对照组小鼠给予慢性孕前应激,连续造模3周。应激结束后,空白对照组及对照组随机取小鼠雌雄合笼交配怀孕,分娩后形成4组：空白对照组、普通应激组、普通分娩组以及应激合并分娩组即PPD模型组。于分娩后3周,检测四组小鼠行为学,包括旷场实验(Open field test, OFT)、强迫游泳测试(forced swimming test, FST)、蔗糖消耗测试(sucrose preference test, SPT)、悬尾测试(Tail suspension test, TST)及陌生环境摄食抑制实验(novelty suppressed feeding test, NSFT),并计算分娩后模型组母鼠与普通分娩组的产仔量及仔鼠的存活率,以评价造模是否成功。此外,检测四组小鼠产后12周的行为学,以评价模型是否具有持久稳定性。2.产后3周,行为学检测结束后,取上述四组的母鼠海马组织,以实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR, Q-PCR)法和western blotting检测海马脑区DISCI的基因及蛋白表达,western blotting法检测NR1、Akt、mTOR、p70s6k、4E-BP1、GluR1的蛋白表达情况；取各组母鼠的血清采用ELISA法检测雌二醇(estradiol,E2)和(皮质酮corticosterone,CORT)的水平了解产后抑郁母鼠的内分泌情况；采用免疫组织化学法检测检测海马神经再生情况。3.模型构建成功后,模型组母鼠随机分为3组,PPD模型组、YG组和Ket组。在产后第20天,YG组单次给予越鞠甘麦大枣汤(越甘),空白对照组和PPD模型组单次给予生理盐水,Ket组以单次西药氯胺酮设为阳性参照组。给药24小时后,进行行为学检测,以评估药物对于PPD动物模型抑郁样行为的快速干预作用。此外,检测单次给药5天后的动物行为学变化,以评估药物干预作用的持久性。4.药物干预24小时动物的行为学测试结束后,取四组的母鼠海马组织,检测海马脑区DISCI的蛋白表达以及NR1、Akt、mTOR、p70s6k、4E-BP1、GluR1的蛋白表达情况,研究中药越甘发挥快速抗抑郁作用的神经分子机制。结果1.孕前应激诱导产生的PPD模型小鼠表现出一系列抑郁样表型。产后3周,与空白对照组比较,模型组母鼠的糖水消耗显著降低；在强迫游泳测试及悬尾测试中,模型组母鼠不动时间显著增加；模型组母鼠摄食潜伏时间明显增加而单位时间摄食量显著减少；空白对照组与普通应激组、普通分娩组之间无统计学差异。模型组母鼠的仔鼠分娩数目显著减少,分娩后3周离乳后仔鼠的存活率也显著下降。此外,行为学实验发现PPD模型小鼠到产后12周仍然表现出一系列抑郁样行为。2.产后3周,产后抑郁模型组母鼠海马DISCI的蛋白表达及mRNA表达较空白对照组相比均显著升高；与空白对照组相比,NR1的蛋白表达明显上调而磷酸化的Akt、mTOR、 p70s6k、4E-BP1及突触后膜蛋白GluR1的蛋白表达均显著下调；此外,与空白对照组相比,模型组母鼠海马齿状回神经元细胞的增殖显著减少；空白对照组与普通应激组、普通分娩组之间无统计学差异；模型组母鼠血清的E2及CORT水平与对照组相比则无明显统计学差异。3.单次给予越甘24小时后,与PPD母鼠模型组相比,越甘组的糖水消耗显著增加,绝望不动时间明显降低,陌生环境摄食抑制实验中的潜伏时间显著缩短,单位时间摄食量明显增加,均表现出与西药氯胺酮相似的结果。给药5天后,与PPD模型组相比,越甘组对模型小鼠抑郁样行为的逆转干预作用依然存在。4.单次给予越甘24小时后,与模型组母鼠相比,越甘组母鼠海马DISCI的蛋白表达显著下调,NR1的表达也明显下调,而磷酸化的Akt、mTOR、p70s6k、4E-BP1及突触后膜蛋白GluR1均显著上调,与氯胺酮的结果相一致。结论1.慢性孕前应激诱导的Bal b/c母鼠产后呈现出一系列抑郁样症状,表型显著且持久稳定。小鼠表现为快感缺失、绝望不动时间延长、伴有焦虑以及母爱关怀行为减少等,并且症状可持续到产后12周,显著地反映出产褥期抑郁障碍的行为表现。2.产后3周,孕前应激诱导的产后抑郁模型小鼠海马脑区DISC1-Akt-mTOR通路表达异常。小鼠海马DISCI蛋白表达及mRNA表达均异常升高,表明其与产后抑郁症的发病密切相关。模型小鼠海马NR1的蛋白表达上调,而Akt、mTOR、p70s6k.4E-BP1及突触后膜蛋白GluR1的蛋白表达显著下调,表明孕前应激通过DISCI及NR1介导的活化而抑制了Akt-mTOR的活性,进而抑制了下游底物p70s6k及4E-BP1的活性,降低了突触后膜蛋白GluR1的神经可塑性调节,减少了新生神经细胞的发生以及神经元的保护和存活,促进了产后抑郁症的发生。3. 中药越甘在PPD小鼠模型上发挥了快速且持久的抗抑郁作用,与氯胺酮相似。中药越甘单次给药24小时后能够显著增加产后抑郁模型母鼠的蔗糖消耗量,降低其在强迫游泳及悬尾测试中的不动时间,在陌生环境摄食抑制实验中减少潜伏时间并增加单位时间的摄食量,并且上述作用可以至少维持5天。4.调控海马DISC1-Akt-mTOR信号通路可能是中药越甘在PPD模型小鼠上发挥快速持久抗抑郁作用的机制之一。越甘能够抑制产后抑郁模型母鼠海马脑区的DISCI的蛋白的异常上调表达,通过下调NRl,介导Akt-mTOR信号传递通路的活化,促进下游底物p70s6k及4E-BP1的级联反应,上调GluR1突触蛋白,增强神经可塑性,从而发挥其快速的抗抑郁作用。
