白藜芦醇对高糖环境下血管内皮细胞的效应和作用机制

目的：糖尿病所致的慢性并发症严重威胁人们的健康,而糖尿病血管病变是最常见的慢性并发症之一。糖尿病血管病变的发病原因为高血糖环境引起血管内皮细胞的损伤。由于糖尿病血管病变目前还没有理想的治疗方法,因而研究相关药物具有重要的意义。白藜芦醇(resveratrol, RSV),是一种多酚类植物抗毒素,近年来发现主要有抗肿瘤、保护心血管、抗氧化、抗衰老作用、保护神经系统、抗菌、抗炎、抗糖尿病作用和调节雌激素样等作用,但白藜芦醇对高糖环境下血管内皮细胞的效应及作用机制尚未完全阐明。相关研究表明一氧化氮(nitric oxide, NO)为内皮依赖性舒张因子,被称为抗粥样硬化因子,E选择素(endothelial leukocyte adhesion molecule 1, E-selectin)为内皮特异性,为粥样硬化因子。本研究通过高糖环境下体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)探讨白藜芦醇对高糖环境下血管内皮细胞中的效应和作用机制,为其在在临床及科研领域的应用提供依据。方法：选取2013年在潍坊市人民医院妇产科取正常分娩的健康新生儿10-15cm的脐带置于无菌脐带保存液,磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)洗净血液,应用0.25%胰蛋白酶室温消化分离脐血管内皮细胞,脐血管内皮细胞接种于含有20%浓度的胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM (dulbecco's modified eagle medium)培养液瓶中,培养液每2-3天更换原培养液的一半以移除未粘附的细胞,并分离细胞、接种细胞,应用免疫组化法识别血管性假血友病因子(von Willebrand factor, vWF)以鉴定人脐静脉血管内皮细胞。细胞成长良好后弃培养液,PBS洗2次,0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)消化并传代,保留第二代和第三代细胞。当覆盖率达到80%时具备实验条件,并作为实验对照组。实验分为对照组,高糖-脂培养组(32.8 mmol/L葡萄糖和0.45 mmol/L棕榈酸),白藜芦醇治疗组(32.8mmol/l葡萄糖、0.45 mmol/L棕榈酸、0.2μmol/l白藜芦醇4小时预处理并在先前制备的含有20%浓度的的DMEM培养液中培养12小时),Trizol法分离RNA,通过RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)以看家基因β-肌动蛋白基因(β-actin gene)作为内参检测E选择素mRNA表达水平。由100 nmol/1胰岛素所诱导30分钟后的培养细胞上清液,用硝酸还原酶法测定分析不同实验组的一氧化氮。通过检测对照组,高糖-高组、白藜芦醇治疗组的E选择素mRNA和NO水平来了解其对血管内皮细胞的作用。紫外分光光度计法测量细胞蛋白浓度。在不包含抗生素的培养基中接种对照组细胞(无高糖-脂处理),细胞融合达60%时通过siRNA沉默E选择素表达,24小时后收集细胞。其中E选择素表达沉默的作为实验组,未沉默的作为对照组。用40 μmol/l、80μmol/l白藜芦醇孵育细胞,RT-PCR检测E选择素mRNA表达以了解沉默效果。HUVECs用含20%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液,实验前饥饿处理。按设定的浓度将白藜芦醇(40μmol/l、80μmol/1)溶解于PBS溶液中,按照分组加入各孔,置于37℃培养箱中后迅速吸出药物溶液,并用4℃的PBS溶液洗3次,再加入1 m1水,将孔中细胞吹下来,液氮中反复冻融3次,高速离心20分钟破碎细胞。高效液相色谱仪测定细胞中白藜芦醇的含量,了解E选择素沉默对细胞白藜芦醇摄取的影响(40μmol/l、80μmol/l).数据结果采用SPSS 17.0统计软件进行统计学检验,计量资料采用壮s表示,计量资料比较采用碧检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1.E选择素基因沉默效果良好。用40μmo/1白藜芦醇浓度处理E选择素基因沉默处理的,其白藜芦醇的细胞摄取量为2.62 nmol/106,低于E选择素基因未沉默处理的(7.61 nmol/106) (P<0.01),用80μmo/l白藜芦醇浓度处理E选择素基因沉默处理的,其白藜芦醇的细胞摄取量5.35 nmol/106,低于E选择素基因未沉默处理的(9.12 nmol/106) (P<0.01)提示E选择素至少部分参与白藜芦醇的细胞摄取过程。2.高糖-脂组E选择素mRNA的表达为0.61,大于对照组的0.52,白藜芦醇治疗组E选择素mRNA表达为0.55,小于高糖-脂组E选择素mRNA表达(P<0.05)。高糖-脂环境下E选择素mRNA表达增高,而白藜芦醇治疗可以减少E选择素mRNA的表达。3.高糖-脂组N0的表达为68.25μmol/l,小于对照组的76.34μmol/l,白藜芦醇高糖治疗组N0的表达为110.27μmol/l,大于高糖-脂组N0的表达(P<0.05)。高糖-脂环境下N0的分泌减少,而白藜芦醇治疗可以增加NO的分泌。结论：白藜芦醇能增加血管内皮细胞NO的分泌,减少E选择素mRNA的表达,起到改善、保护高糖-脂培养的内皮细胞的作用,因此可能成为预防和治疗糖尿病血管病变方面的药物。