非洲猪瘟病毒微滴数字PCR(ddPCR)方法的建立及应用

被引：41

作者：

邬旭龙 ^{[1
]}

肖璐 ^{[2
]}

宋勇 ^{[3
]}

林华 ^{[4
]}

陈世界 ^{[4
]}

杨苗 ^{[4
]}

安微 ^{[4
]}

姚学萍 ^{[1
,5
]}

杨泽晓 ^{[1
,5
]}

王印 ^{[1
,5
]}

机构：

[1] 四川农业大学动物医学院动物检疫实验室

[2] 四川省畜牧科学研究院

[3] 天津瑞普生物技术股份有限公司

[4] 四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心

[5] 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室

来源：

微生物学通报 | 2017年 / 44卷 / 12期

关键词：

微滴数字PCR; 实时荧光定量PCR; 非洲猪瘟病毒; 诊断调查;

D O I：

10.13344/j.microbiol.china.170502

中图分类号：

S852.65 [家畜病毒学];

学科分类号：

摘要：

【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)能导致猪群高死亡率,从而造成严重的经济损失。因此,建立严密、高效的防控系统,包括灵敏、准确的诊断方法以及高效的预报预警机制等,以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而高灵敏度的ASFV微滴数字PCR(Droplet digital PCR,dd PCR)检测方法。【方法】针对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化,建立了ASFV实时荧光定量PCR(q PCR)和dd PCR检测方法;并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异性和重复性进行了评估,利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血清样本进行检测,血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检,评估不同方法检测结果的符合率。【结果】建立的ASFV q PCR和dd PCR检测方法线性关系较好(R2≥0.998),dd PCR的最低检测限度可达到0.36拷贝,在20μL反应体系中约为10拷贝/反应,检测灵敏度是q PCR的10倍。ASFV dd PCR检测方法具有很高的特异性和重复性,不与其他猪常见病毒发生交叉反应。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,可作为一种有效的分子生物学方法来诊断ASFV,为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供新的技术储备,同时促进dd PCR技术在我国的发展和应用。

引用

页码：2839 / 2846

页数：8

共 15 条

[11] No evidence of African swine fever virus replication in hard ticks [J].

Ferreira, Helena C. de Carvalho ;

Zuquetec, Sara Tudela ;

Wijnveld, Michiel ;

Weesendorp, Eefke ;

Jongejan, Frans ;

Stegeman, Arjan ;

Loeffen, Willie L. A. .

TICKS AND TICK-BORNE DISEASES, 2014, 5 (05) :582-589

[12] Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction [J].

Sedlak, Ruth Hall ;

Jerome, Keith R. .

DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASE, 2013, 75 (01) :1-4

[13]

African swine fever virus controls the host transcription and cellular machinery of protein synthesis.[J].Elena G. Sánchez;Ana Quintas;Marisa Nogal;Alfredo Castelló;Yolanda Revilla.Virus Research.2012,

[14]

Design and verification of a highly reliable Linear-After-The-Exponential PCR (LATE-PCR) assay for the detection of African swine fever virus.[J]..Journal of Virological Methods.2010, 1

[15] Expression, cellular localization and antibody responses of the African swine fever virus genes B602L and K205R [J].

Gutierrez-Castaneda, B. ;

Reis, A. L. ;

Corteyn, A. ;

Parkhouse, R. M. E. ;

Kollnberger, S. .

ARCHIVES OF VIROLOGY, 2008, 153 (12) :2303-2306

← 1 2 →