高糖条件下高表达ARNO对人肾小球内皮细胞通透性的影响及其作用机制

目的探讨高糖条件下高表达ARNO对人肾小球内皮细胞(HRGEC)通透性的影响及其作用机制。方法体外培养HRGEC,分别观察不同时间梯度(15、30、45和60 min)和浓度梯度(10、20、30和40 mmol/L)高糖作用对ARNO蛋白表达和内皮细胞通透性的影响。分别采用ARNOsiRNA和Arf6siRNA重组慢病毒载体感染HRGEC,获得沉默ARNO和Arf6的HRGEC细胞株,观察ARNO和Arf6基因沉默对内皮细胞通透性的影响。结果时间梯度实验中,与高糖对照组相比,高糖15、30、45、60 min组HRGEC ARNO表达明显升高(分别为0.670±0.051、0.960±0.106、0.716±0.026、0.531±0.030vs.0.242±0.029),差异有统计学意义(P<0.05),与高糖15 min组相比,高糖30 min组ARNO表达升高(P<0.05),与高糖30min组相比,高糖45 min组ARNO表达回落(P<0.05),与高糖45 min组相比,高糖60 min组ARNO表达降低(P<0.05)。与高糖对照组相比,高糖15、30、45、60 min组内皮细胞通透性明显增加(分别为1.196±0.004、1.399±0.012、1.301±0.052、1.184±0.030vs.1.000),差异有统计学意义(P<0.05),与高糖15 min组相比,高糖30 min组通透性增加(P<0.05),与高糖30 min组相比,高糖45 min组通透性下降(P<0.05),与高糖45 min组相比,高糖60 min组通透性下降(P<0.05)。浓度梯度实验中,与正常糖组相比,高糖20、30、40 mmol/L组HRGEC ARNO表达明显升高(分别为0.632±0.031、0.927±0.041、1.183±0.098 vs. 0.169±0.033),差异有统计学意义(P<0.05),且随高糖浓度增加,ARNO表达呈递增趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常糖组相比,高糖10、20、30、40 mmol/L组内皮细胞通透性明显增加(分别为1.147±0.015、1.237±0.023、1.351±0.015、1.444±0.019 vs. 1.000),差异有统计学意义(P<0.05),且随高糖浓度增加,内皮细胞通透性呈递增趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。转染慢病毒后,与正常糖未转染组及正常糖空载体组相比,正常糖ARNO siRNA组ARNO mRNA转录明显降低(0.255±0.056 vs.1.000、1.183±0.297),ARNO蛋白表达明显降低(0.088±0.005vs.0.246±0.011、0.237±0.009);正常糖Arf6siRNA组Arf6 mRNA转录明显降低(0.314±0.090 vs. 1.000、1.140±0.236),Arf6蛋白表达明显降低(0.690±0.012 vs. 0.917±0.009、0.919±0.009),差异均有统计学意义(P<0.05)。沉默内皮ARNO后,与高糖未转染组及高糖空载体组相比,高糖ARNO siRNA组ARNO蛋白表达明显降低(0.572±0.021vs.0.915±0.005、0.916±0.012),Arf6活性明显降低(0.263±0.007vs.0.484±0.014、0.490±0.008),细胞通透性也明显降低(0.718±0.017vs.1.000、0.978±0.040),差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,沉默内皮Arf6后,与高糖未转染组及高糖空载体组相比,高糖Arf6siRNA组Arf6蛋白表达明显降低(0.673±0.015 vs. 0.932±0.020、0.899±0.022),内皮细胞通透性也明显降低(0.768±0.050 vs. 1.000、0.978±0.040),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论高糖诱导的HRGEC高通透性与ARNO/Arf6信号活化有关,抑制ARNO的表达及Arf6活性可抑制糖尿病肾病肾小球内皮的高通透性。