弓形虫SAG1基因截短片段植物表达载体的构建

目的　将弓形虫SAG1基因截短片段 (t SAG1) ,分别用植物组成型E35S启动子和番茄果实特异性E8启动子驱动 ,构建t SAG1植物表达载体。方法　自本室构建的pET32a t SAG1载体中PCR扩增得到t SAG1基因 ,克隆进T载体为pMD T t SAG1,酶切鉴定后进行测序确认。用BamHⅠ单酶切连接方式将t SAG1分别亚克隆进 pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG载体 ,分别构建中间载体 pB35 t SAG1、pB35E1 t SAG1、pBE2 t SAG1载体。其中 ,pB35 t SAG1以E35S驱动t SAG1,3′端携带NOS3′终止子序列 ,组成E35S/t SAG1/NOS3′操纵子结构单元。pB35E1 t SAG1含E35S和番茄果实特异性E8启动子核心序列E81.1双启动子驱动t SAG1,组成E35SE81.1/t SAG1/NOS3′操纵子结构单元。pBE2t SAG1以番茄果实特异性E8启动子全长E82 .2驱动t SAG1,组成E82 .2 /t SAG1/NOS3′操纵子结构单元。pB35 t SAG1、pB35E1 t SAG1、pBE2 t SAG1经酶切证实后 ,分别将其中E35S/t SAG1/NOS3′、E35S -E81.1/t SAG1/NOS3′、E82 .2 /t SAG1/NOS3′操纵子结构单元以HindⅢ单酶切连接方式亚克隆进pCAMBIA2 30 0质粒中 ,构建植物表达载体 pC35 t SAG1、pC35E1 t SAG1、pCE2 t SAG1,酶切鉴定。含三种启动子驱动t SAG1的植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4 4 0 4感受态细胞后 ,