抑制性消减杂交技术结合cDNA MICROARRAY技术在中国明对虾WSSV感染后差异表达基因研究上的应用附视频

以中国明对虾WSSV感染6h的头胸部组织为实验材料,提取总RNA分别进行正反向抑制性PCRcDNA消减杂交,消减杂交后的PCR产物经纯化并克隆到T载体,进而转化成正反向消减文库。消减文库库容分别为:正向库,3.7×104;反向库,1.2×104。利用消减文库的克隆构建了cDNA表达谱芯片,共有1536个靶点,其中正、反向文库各768个。使用该cDNA芯片对WSSV感染后6h的对虾组织进行了表达谱分析,对其中80个出现明显表达调控变化的阳性克隆进行了测序。结果显示,在WSSV感染后6h,病毒基因开始大量表达,而宿主糖酵解,嘌呤、嘧啶代谢以及精氨酸代谢等代谢途径的关键基因出现明显下调。这表明病毒已在宿主体内大批量复制并开始抑制宿主代谢。病毒上调表达的WSV482可能与病毒毒力的增强有关,而宿主蛋白的管家基因如Actin,EFα的下调表达提示:在利用基因表达技术研究WSSV病毒的实验中,管家基因的选择要十分慎重。此外,根据作者已有的研究结果,TPI基因是比较好的候选管家基因。而WSV414、WSV215和WSV482是对WSSV进行RNA干涉实验较好的候选靶标基因。